陈辛玲，鲍 金，李 苒，丁 琦，刘辉琦，王生兰

    (青海大学，青海 西宁 810001)

    现有的研究表明，肺动脉高压(pulmonary hypertension，PAH)的发生、发展和肺动脉中膜的平滑肌细胞的异常增殖密切相关[1]；已有报道显示骨桥蛋白(osteopontin，OPN)可以调控腹主动脉瘤的平滑肌细胞增殖及自噬[2]。本文拟探讨OPN对肺动脉平滑肌细胞增殖、自噬的影响及其机制。

    1.材料与方法

    1.1 实验动物与主要试剂

    体重约150～160 g的SD大鼠{SPF级，西安科奥有限责任公司[许可证号：SCXK(陕)2018-001]}。OPN生物制品(R&D systems，USA)，α-SMA抗体、Beclin1蛋白抗体、LC3B蛋白抗体、p38MAPK蛋白抗体、β-actin蛋白抗体、P-p38MAPK蛋白抗体(Abcam公司，英国)，辣根酶标记山羊抗兔二抗(abclonal公司，中国)，Beclin1、LC3B、β-actin引物(凯杰生物，德国)。

    1.2 研究方法

    1.2.1 原代肺动脉平滑肌细胞分离

    用3%的戊巴比妥钠溶液(150mg/kg)行腹腔注射麻醉后处死大鼠，置75%的乙醇浸泡消毒。沿大鼠剑突剪开胸腔后取出心肺组织。在超净工作台中剪掉心脏并将肺组织置培养皿中，用PBS清洗肺组织，用针头将肺组织固定于泡沫板上。在主动脉弓附近找到肺动脉干，用眼科镊夹住肺动脉主干，用手术刀沿肺动脉主干向下逐级刮除肺组织。分离出二、三级肺动脉后将其剪断并转移至加有培养基的培养皿中，纵行剪开肺血管，用手术刀轻轻刮除内皮细胞后缓慢撕下外膜，用眼科剪将中层平滑肌组织剪成约1.5 mm3的小块， 再将剪好的组织块均匀铺到25 mm2的培养瓶中，培养瓶底部预先加入4 mL的含20%血清的DMEM/F12完全培养基，将培养瓶直立放置于培养箱中，4～6 h后将培养瓶水平放置使组织块浸入培养基。

    1.2.2 肺动脉平滑肌细胞鉴定

    细胞培养至第二代时，用含0.02%EDTA的0.25%胰酶将细胞消化后，以1×105/mL的密度接种于有盖玻片的24孔板中并置于培养箱中培养，等每孔细胞密度达到80%左右时弃去培养基，用PBS洗涤3次，用4%多聚甲醛于4 ℃条件下固定15 min；弃去甲醛，用1×PBS冲洗3次，每次5 min；用0.5%TritonX -100于室温下透膜15 min；用5%BSA溶液于37 ℃孵育1 h，甩干勿洗；滴加稀释(1：100)的α-SMA一抗于盖玻片上 ......