刘辉琦，杰永生，郑 蕊，綦 惠，陈 磊，靳少锋，舒 雄△

    (1.青海大学医学院，青海 西宁 810001；2.北京市创伤骨科研究所/北京积水潭医院，北京 100035)

    研究显示，HSP90家族与肿瘤关系密切。该家族主要有HSP90α、HSP90β两种同分异构体，尽管二者同源性为84%，但生物学特性仍有所差别。目前认为，HSP90α可通过调节细胞周期促进细胞增殖，参与肿瘤细胞的增殖，而HSP90β与肿瘤细胞分化相关。因此，尽管两种异构体在多种肿瘤中表达增加，但在不同肿瘤中的表达强度有所差异。研究提示HSP90β在胃癌、结肠癌、骨肉瘤等多种肿瘤中表达明显增强[1，2]，与肿瘤侵袭、耐药等相关[3，4]，进而影响肿瘤的发展及预后。为明确HSP90β与骨肉瘤侵袭的关系，本研究通过慢病毒介导的干扰及过表达探讨HSP90β对人骨肉瘤细胞系MG-63侵袭的影响。

    1.材料与方法

    1.1 材料

    人骨肉瘤细胞系MG-63(美国ATCC公司)；EMEM液体培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；All-in-One First Strand cDNA Synthesis Kit和All-in-One qPCR Mix(美国GeneCopoeia公司)；感染试剂Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)；RNAzol?RT(美国Molecular Research Center公司)；小鼠抗人HSP90β单克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体(美国Abcam公司)；兔抗人MMP2单克隆抗体、兔抗人Snail单克隆抗体、兔抗人E-cadherin单克隆抗体(美国CST公司)；PierceTMBCA Protein Assay Kit(美国Thermo公司)。其他相关生化试剂为进口分装或国产分析纯产品。

    引物合成及测序由美国GeneCopoeia公司完成。

    1.2 方法

    1.2.1 HSP90β的扩增和干扰靶点设计及引物合成

    提取MG-63基因组DNA，合成正向引物F-HSP90β(5′-GCGGTAGGCGTGTACGGT-3′)、反向引物R-HSP90β(5′-CTGGAATAGCTCAGAGGC-3′)，以基因组DNA为模板扩增合成目的基因h-HSP90β的CDS区域。根据shRNA设计原则，按照人HSP90β基因的mRNA序列(GeneBank Accession No.NM_003299.1)设计shRNA靶序列和对照病毒载体序列(靶病毒序列：F 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；R 5′-CTGGAATAGCTCAGAGGC-3′ ......