管晓燕，李 敏，刘建国，李 虎，白国辉，肖茜文，张丁文，董竞男

    (1.遵义医学院 口腔学院，贵州 遵义 563099；2.贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，贵州 遵义 563099)

    龋病是由细菌引起的牙体硬组织的慢性感染性疾病，链球菌属的变异链球菌是重要的致龋菌，葡萄基转移酶(Glucosyltransferase, GTF)是其重要的毒力因子之一，也是主要的免疫抗原[1]。GTF的催化活性区(Catalytic, CAT)可以催化蔗糖水解酶的活性，使其产生葡聚糖，对变异链球菌在牙面的附着和龋病发生有着重要的作用。研究已经证实，以GTF和GTF/ CAT为抗原免疫动物能够有效地控制龋病发生。为了提高基因疫苗的免疫原性，增强免疫应答，更好地保护宿主，选择具有缓释功能的递送系统搭载基因疫苗已经成为研究热点，缓释系统能够保护疫苗本身的性质不受破坏，为疫苗发挥作用提供了有利环境。课题组前期已成功构建了防龋基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT，制备了以温敏型生物降解水凝胶PLGA-PEG-PLGA作为缓释系统的水凝胶型防龋基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT[2-3]。本实验将该水凝胶型防龋基因疫苗经口服和鼻腔黏膜滴注两种途径免疫新西兰大白兔，观察特异性抗体的动态变化及其在动物免疫部位的蛋白表达，分析水凝胶型防龋基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT的免疫原性，为后续实验提供一定的实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 新西兰大白兔20只，雄性，普通级(购于第三军医大学野战外科研究所医学实验动物中心，许可证号：SCXK(渝)20070005)。

    1.2 主要试剂及主要仪器 PLGA-PEG-PLGA(由电子科技大学微电子与固体电子学院郝建原教授提供)；鼠抗GTF多克隆抗体(课题小组前期制备)；辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG (美国Amresco公司)；辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgA(美国Genet公司)；SP法免疫组化试剂盒(博士德公司)；生物素标记的第二抗体(博奥生物公司)；变异链球菌GTF(课题小组前期分离纯化)；重组质粒pVAX1-gtfB/CAT(课题小组前期构建)；空载体质粒pVAX1(美国Invitogen公司)；酶联免疫检测仪(美国Instruments.Inc公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)，柱式质粒(大量)纯化试剂盒(美国Omega公司)。

    1.3 重组质粒pVAX1-gtfB/CAT和空载体质粒pVAX1的制备 采用柱式质粒(大量)纯化试剂盒按说明书制备重组质粒pVAX1-gtfB/CAT和空载体质粒pVAX1 ......