向红英，兰小松，吕延成

    (遵义医学院珠海校区 生物化学教研室，广东 珠海 519040)

    Ⅱ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 2，HSV-2)是一种具有包膜的DNA病毒，是造成皮肤、黏膜和神经等外胚层慢性感染和经常性生殖器溃疡的主要病毒之一[1]，利用短发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体转入哺乳动物细胞产生小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)可以干扰HSV-2基因的表达[2-5]。本研究利用带有多个启动子的表达质粒，针对HSV-2的UL27和UL54构建了一种可同时表达双短发卡RNA(Duo-shRNA)的重组载体，通过与单-shRNA重组表达载体进行比较，探讨其对HSV-2病毒复制的影响。

    1 材料与方法

    1.1 材料与仪器 HSV-2333病毒株标准品购于广州博特生物技术公司，人胚肾293细胞株(HEK293)和E.coliDH5α由本校区生物化学与分子生物学实验室提供，带有多个启动子的pGenesil10-3p质粒(见图1)及用于表达shRNA的寡核苷酸链由武汉市淅玛生物技术有限公司提供并进行连接构建。 限制性内切酶BbsI、BamH I和PstI、TRIzol试剂购自日本Takara公司，SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自日本Toyobo公司，新生牛血清购自中国杭州四季青公司，质粒小量提取试剂盒购自中国杭州爱思进生物技术有限公司，HSV-2 gB和ICP27抗体分别购于美国Santa Cruz Biotechnology公司和Abcam公司，Lipofectamine2000转染试剂盒和DMEM分别购自美国Invitrogen公司和Gibco公司。

    主要仪器有产自中国苏州净化设备厂的YJ-1450型医用净化工作台，德国徕卡公司的Elx-800型全自动酶标仪，德国eppendorf公司的5810R台式冷冻离心机及美国SHEL公司的CO2培养箱等。 ......