确保IVD检测结果真实可靠——中国、美国及WHO新冠病毒核酸检测试剂审评要求简要对比 等
□ 李红然 董劲春
自新冠肺炎疫情发生以来，各国监管机构和体外诊断试剂(IVD)企业陆续采取措施，积极助力疫情防控。国家药品监督管理局第一时间启动应急审批程序。1月20日，国家药监局医疗器械技术审评中心(以下简称器审中心)起草《2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》(以下简称《审评要点》)，并于2月12日在其官网对外发布。
世界卫生组织(WHO)于1月8日修订了《紧急使用清单(EUL)程序》(Emergency Use Listing Procedure)，并于2月28日发布《SARS-CoV-2核酸检测试剂申报要求指南》(以下简称《要求指南》)。
美国FDA于2月29日发布指南《公共卫生突发事件期间在经CLIA认证可开展高复杂性检测的实验室于紧急使用授权(Emergency Use Authorization，EUA)批准之前进行2019新冠疾病诊断检测的政策》(以下简称《检测政策》)。3月16日，FDA更新了该指南，增加了无需提交EUA的政策及适用生产商的政策。
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对比中国、美国及WHO上述文件对新冠病毒核酸检测试剂的审评要求，我们不难发现在适用范围、质量控制等方面存在差异。
文件适用范围不同
我国器审中心发布的《审评要点》针对我国IVD生产企业，用于指导其产品申请在我国境内上市的注册资料申报。
WHO《要求指南》面向的是全球企业，目的是帮助制造商提交WHO EUL流程申请，该EUL流程的制定旨在保障公共卫生突发事件期间所需IVD的可及性，并基于安全有效性数据等基本质量要求，协助联合国相关采购机构和成员国确定在公共卫生突发事件期间使用特定产品的可接受性。WHO提供的通道适用于全球采购，因此，《要求指南》中的临床证据部分描述了对入组说明书中声称的各类人群及各使用地区样本的要求。
FDA《检测政策》提供了灵活的加速新冠病毒检测的方式，使用经CLIA认证可开展高复杂性检测的实验室开发的试剂，在完成产品验证后、申请EUA之前(一般不超过申请之前15个工作日)，允许开展新冠病毒临床样本检测。对于州/地区授权的辖区内经CLIA认证可开展高复杂性检测的实验室，使用该实验室开发的新冠病毒检测试剂检测样本，在州/地区政府为检测结果负责的前提下，无需向FDA提交EUA申请。对于新冠病毒检测试剂生产商，在完成产品验证后、申请EUA之前(一般不超过申请之前15个工作日)，允许销售试剂给实验室进行样本检测。FDA对上述实验室或生产商开发产品的验证要求是一致的。
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质量控制措施不同
WHO EUL程序包括质量管理体系审查和上市后监管计划，以及评估试剂产品安全有效的档案审查。
我国在新冠病毒检测试剂应急审批过程中，需对申报产品进行技术审评、质量管理体系考核和上市后监管，与WHO要求一致。向WHO提交EUL程序的IVD企业必须保证其产品在适当、充分且有效的质量管理体系(QMS)下制造。因此，评估申报产品的第一步就是对制造商的QMS文档进行评估，只有在充分证明申请人是制造商且有适当的QMS证据和制造能力时，才可继续走审评流程。我国此次应急审批工作与WHO相似，在收到国家药监局转来的应急审批产品名单后，器审中心第一时间与相关企业联系，了解产品和申请人QMS情况，确认产品是否在有效的QMS条件下生产。相关省级药监局迅速启动质量管理体系核查，并将核查进度和结果反馈器审中心，《审评要点》亦强调“企业应提交在符合质量管理体系的生产环境下生产的试剂盒进行的所有性能验证的研究资料”。FDA两版指南均未提及质量管理体系相关要求。
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对于产品档案，WHO EUL程序要求提交产品描述信息以及产品安全有效性证据。对新申报产品，如未进行充分的分析和/或临床性能研究，亦可接受合理的人工样本模拟研究，在初步证据可支持产品安全有效的情况下，可不进行法规要求的全部研究。
我国在新冠病毒核酸检测试剂应急审批中，亦认可有限性证据。监管部门可在目前有一定安全有效性证据，可基本保证产品质量，但证据尚不完全充分的情况下，批准应急产品上市。
FDA签发 EUA需要的有效性证据水平为“可能有效”，低于FDA日常产品批准的“有效”标准。
WHO和我国均要求明确申报产品的主要原材料/成分信息，但WHO仅要求对其简单描述。我国则要求明确主要原材料的验证过程和质量控制标准，并将主要原材料的来源和质量控制标准在产品技术要求附录中载明，以注册证附件的形式进行固定。此外，我国要求建立稳定的企业参考品，用来进行日常生产过程中产品的半成品检验和成品检验。通过对原材料和企业参考品严格要求，保证生产原料、半成品和成品质量稳定可控。
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我国要求新冠病毒核酸检测试剂盒中应具备质控体系，包括阴性质控品、阳性质控品和内标，质控体系应参与样本处理、核酸平行提取和检测全过程，以对核酸提取和PCR扩增、试剂/设备、交叉污染等环节或关键步骤进行合理质量控制，避免检测过程中的假阴性和假阳性。WHO和FDA均未对试剂盒中的质控体系提出要求。
确保临床试验质量路径不同
各文件对检测试剂临床试验的要求也各不相同，主要体现在以下几个方面。
对临床试验机构的要求
WHO允许检测试剂的临床试验未全部完成，但其必须具有部分临床证据以确认临床性能。WHO和FDA均未对临床试验机构进行要求。
我国要求，同一检测试剂产品需在3家以上临床试验机构进行临床试验，如临床试验机构条件允许，推荐多家生产企业的试剂盒在相同的临床试验机构共同验证。
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对临床样本的要求
WHO要求，纳入各使用地区的样本应进行50个前瞻性阳性样本研究。如果前瞻性研究难以实现，亦可接受回顾性研究。应至少检测25个真实临床阳性样本，其余样本可以是由向阴性临床样本基质中添加新冠病毒制作的人工样本，临床特异性评价需要收集有症状个体的至少100份阴性样本。
考虑到阳性样本难以获取，FDA推荐实验室通过人工样本来确认检测试剂的临床性能，要求至少检测30个反应性人工样本和30个非反应性样本，反应性人工样本可以通过将RNA或灭活病毒掺入剩余临床样本中制备。对于CLIA认证实验室开发的试剂，在等待EUA申请结果的同时，FDA建议实验室采用经EUA授权的方法，对申报试剂检测的前5个阳性和前5个阴性临床样本的结果进行确认。
我国建议，检测试剂临床试验入组确诊病例不少于200例，排除病例不少于300例，检测样本可为临床样本或者经提取后的核酸提取液。由此可见，我国要求的临床试验例数更多且均要求真实临床样本，所获得的临床证据更加真实和充分。
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对临床试验入组人群的要求
WHO要求，检测试剂的临床试验应纳入说明书声称的各类人群，但是未具体描述适用人群的概念和范围。我国明确适用人群为新冠肺炎疑似病例，要求入组确诊和排除病例均应有一定例数，包括部分前期核酸检测阴性的确诊病例、解除隔离和符合出院标准的病例，入组病例应包括不同临床严重程度、不同病程阶段的患者。
由此可见，我国要求的临床试验入组人群更加具体和全面，覆盖了产品在实际临床应用中的所有情况。FDA未对临床评价入组人群进行要求。
对临床试验对比方法的要求
WHO推荐的临床试验对比方法为：对于临床样本，将检测试剂与FDA EUA或WHO EUL 列出的PCR检测进行对比；对于人工样本，将检测试剂结果与预期结果进行比较。FDA要求的临床证据来自于人工样本和CLIA认证实验室在等待EUA申请结果时检测的10个临床样本。其中，人工样本的试剂检测结果应与其预期结果进行比较，临床样本的试剂检测结果应采用经EUA授权的方法进行确认。如果任何一个结果不符合要求，实验室应通知FDA，并且采取其他合适的措施，如终止检测患者样本，并发布声称之前检测结果可能无效的更正测试报告。
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我国要求，新冠病毒核酸检测试剂临床试验应选择已上市的同类产品作为对比产品，同时结合试剂检测结果与临床确诊/排除结果进行综合对比。其中，临床确诊病例应依据国家卫健委发布的新冠病毒感染病例确认程序判定，不建议采用某一试验地点的单次试验结果作为确认结果。由此可见，我国要求的临床试验对比方法综合对比试剂和感染病例确认程序，结果更加准确。
对临床试验结果统计分析的要求
WHO和FDA对临床结果的统计分析，仅要求计算一致性百分比。我国要求的统计分析对结果数据的挖掘更加充分，具体分析内容包括试剂符合率、临床灵敏度、临床特异性及其置信区间，人口学分析，不同人群的分层统计，不同样本类型的分别分析以及不一致结果分析。
(注：本文所引相关文件的更新日期截止到2020年3月25日)
(作者单位：国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心)
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确保IVD检测结果真实可靠(下) ——中国、美国及WHO新冠病毒核酸检测试剂审评要求简要对比
□ 李红然 董劲春
性能指标有所不同
中国、美国及WHO新型冠状病毒核酸检测试剂审评对于检测试剂性能的要求各不相同，主要体现在以下几个方面。
核酸提取/纯化性能
WHO和FDA均未对检测试剂配套提取试剂的性能提出要求。新冠病毒属于RNA病毒，需要提取分离得到RNA方可检测，且由于采集样本常为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等，可能存在病毒载量低、PCR抑制物影响反应进行等问题，因此，提取并富集目的核酸，纯化去除PCR抑制物尤为重要。我国要求对配合检测试剂使用的核酸提取/纯化试剂的提取效率、提取核酸纯度等指标做充分验证，以确保检测反应顺利进行和反应体系可控。但是对于特殊方法学的产品，如果试验设计无核酸提取步骤，在性能验证充分且符合要求的情况下，也可以获得批准。
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病毒样本包容性验证
目前，研究发现新冠病毒已产生百余个突变位点，如果检测试剂引物探针结合位置的核酸序列发生突变，可能会影响检测结果。对此，我国要求在引物、探针设计阶段，应通过序列比对和试验等方式，对病毒进行包容性和特异性(比如交叉反应)评价，选择最佳的引物探针组合。在性能评估中，应至少验证具有时间和区域特征的10个不同来源病毒样本，以尽量证明检测试剂可以检测不同病毒株。FDA仅要求采用计算机序列比对方式分析包容性，未要求通过真实病毒进行试验验证。WHO对包容性相关序列分析和试验验证均未进行要求。
精密度评价方法
我国对检测试剂精密度评价提出了要求，明确应采用若干临床样本进行精密度评价，不可仅采用模拟样本，精密度评价试验应包含核酸分离/纯化步骤。此外，我国还设置了各样本的精密度评价标准，通过明确具体要求，确保精密度验证的充分性。WHO未提出上述要求，仅概括性地描述了精密度的影响因素和样本浓度水平。FDA指南未提及对精密度的要求。
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计量学溯源性
WHO表示，目前尚无新冠病毒核酸检测国际标准品，一旦建立相关国际标准品(IS)或参考物质，应根据已建立的IS或参考物质对试剂进行校准。目前，试剂应溯源至经验证的新冠病毒检测参考物质。WHO要求制造商参加合作研究，以评估临时性IS。
我国的相关要求与WHO基本一致，在审评过程中，要求采用科学的方法标定病毒滴度，进行最低检出限相关的量值研究。中国食品药品检定研究院建立了应急用国家参考品，可评估各申报试剂的相对灵敏度，但并未对参考品进行定值，所得结果仅可体现各申报试剂的平行比对信息，无法体现病毒量值。目前我国批准的新冠病毒核酸检测试剂均为定性检测试剂。FDA指南未提及量值研究。
最低检出限研究方法
我国和WHO、FDA对检测试剂最低检出限研究方法的要求基本一致，均为采用梯度稀释，多次重复测定获得具有95%阳性检出率的浓度水平。不同的是，WHO允许使用体外转录或装甲RNA等模拟样本进行最低检出限研究，未要求必须使用病毒样本或核酸提取液作为样本；FDA指南接受采用RNA或灭活病毒掺入人工基质或真实临床样本基质制成的样本，但是未表示接受体外转录或装甲RNA等模拟被测物；我国要求至少采用不同来源的3个具有代表性的新冠病毒样本或假病毒，以及另外3个不同真实临床样本或核酸提取液，分别进行最低检出限确定和验证。
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如果同一检测试剂适用多种基质样本类型，FDA推荐制造商在EUA申请中仅提交其采用最具挑战性临床基质进行的最低检出限研究结果。例如，若试剂可检测痰液、支气管肺泡灌洗液、鼻咽拭子等呼吸道样本，制造商应仅提交痰液样本的最低检出限结果。我国和WHO均要求，对于每种声称适用的样本类型，均应进行最低检出限研究。相比FDA，我国和WHO的要求更加严格。
特异性分析方法
WHO要求，对于常规PCR检测试剂或者测试前使用完善的提取方法提取的试剂，检测呼吸道或血浆样本时可不进行干扰研究；对于新的提取方法或等温扩增等非常规PCR产品，需要对潜在的干扰物进行测试。考虑到RNA逆转录酶比DNA聚合酶更易受到其他物质干扰，为充分发现潜在干扰物质，我国要求所有检测试剂均应进行干扰研究。
对于推荐研究的潜在干扰物质种类，WHO和我国基本一致，但是WHO仅描述了干扰物质的类别，而我国列举出了干扰物质类别和具体物质/活性成分，有利于申请人执行该要求，保持审评尺度一致。对于推荐研究的交叉反应物质，WHO和我国要求的病原体大部分相同，但亦各自存在不同的病原体，这可能与不同地区出现的感染病原体种类不同有关。值得一提的是，我国明确要求了交叉病原体种类和具体型别，且种类相对较多，有利于确保验证的充分性。
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适用机型评估资料提交
由于新冠病毒核酸检测试剂需要采用实时荧光定量PCR仪进行检测，不同厂家和型号的仪器存在差异，可能会导致实验条件和扩增效率不同。因此，我国要求对于适用于多个机型的试剂，产品说明书【适用机型】项中应列出所有型号仪器的性能评估资料。
WHO和FDA对性能评估的要求均未考虑机型因素。
样本性能评估项目
WHO要求，应对每种样本类型(例如不同的拭子类型或病毒转运介质等)进行基质等效性研究及最低检出限和临床特异性研究。
我国规定，不同样本类型应分别进行性能评估验证。一般来说，我国要求的不同样本类型为咽拭子、痰液和肺泡灌洗液等，在最小负担原则的前提下，并未要求对不同拭子及转运介质进行全性能评估。
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FDA指南并未考虑不同样本类型和基质的验证，仅表示在最低检出限研究中应采用最具挑战性临床基质进行试验。
阳性判断值设置
阳性判断值指通过试剂检测结果判断样本是否达到病毒核酸的临界Ct值，是检测结果的判断依据，阳性判断值设置合适与否，直接关系到是否会出现假阳性或假阴性结果。我国要求提交阳性判断值确定资料，并对该研究提出了具体要求。WHO和FDA均未要求提交该资料。
样本及试剂稳定性研究
WHO要求，在不同条件下，应至少测试10个样本的稳定性。因为考虑样本稳定性属共性特征，与样本例数关系不大，我国并未要求样本稳定性研究的例数。
WHO和我国均要求进行试剂稳定性研究，如果时间有限，可提交尚未完成的实时稳定性试验资料，资料中应包含研究计划和当前的研究结果。企业应在产品上市后继续完成实时稳定性研究。
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主要生产工艺研究资料提交
我国需提交确定产品主要生产工艺的研究资料，同时提供反应体系的详细研究资料，以评价产品生产和使用过程的科学性。WHO和FDA均未要求提交该资料。
检测能力描述方式
WHO要求提交检测能力相关资料，描述申报产品的样本通量/容量、执行检测所需的时间(从临床样本采集到获得检测结果)，以及每台仪器每天可进行的检测次数。器审中心与企业沟通时，均会了解产品测试通量和速度等信息，但是未将该内容写入审评要点，未将其作为申报资料的一部分进行提交。在疫情防控的紧急状态下，将审评资源集中在通量高、速度快、易于推广应用的产品上，是更加科学高效的选择。
综上所述，我国对新冠病毒核酸检测试剂的要求比较充分和明确，在疫情防控应急状态下，接受有限的证据，但在可实现的情况下，要求产品的安全有效性证据尽量充分。此外，我国的检测试剂审评要点要求更加细化，不仅有利于申请人在产品验证确认过程中一步到位，不走弯路，还有利于审评尺度保持一致。同时，我们也注意到，国际监管机构在某些方面具有先进经验，值得我们学习和借鉴。
(注：本文所引参考文献截止到2020年3月25日)
(作者单位：国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心)
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自新冠肺炎疫情发生以来，各国监管机构和体外诊断试剂(IVD)企业陆续采取措施，积极助力疫情防控。国家药品监督管理局第一时间启动应急审批程序。1月20日，国家药监局医疗器械技术审评中心(以下简称器审中心)起草《2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》(以下简称《审评要点》)，并于2月12日在其官网对外发布。
世界卫生组织(WHO)于1月8日修订了《紧急使用清单(EUL)程序》(Emergency Use Listing Procedure)，并于2月28日发布《SARS-CoV-2核酸检测试剂申报要求指南》(以下简称《要求指南》)。
美国FDA于2月29日发布指南《公共卫生突发事件期间在经CLIA认证可开展高复杂性检测的实验室于紧急使用授权(Emergency Use Authorization，EUA)批准之前进行2019新冠疾病诊断检测的政策》(以下简称《检测政策》)。3月16日，FDA更新了该指南，增加了无需提交EUA的政策及适用生产商的政策。
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对比中国、美国及WHO上述文件对新冠病毒核酸检测试剂的审评要求，我们不难发现在适用范围、质量控制等方面存在差异。
文件适用范围不同
我国器审中心发布的《审评要点》针对我国IVD生产企业，用于指导其产品申请在我国境内上市的注册资料申报。
WHO《要求指南》面向的是全球企业，目的是帮助制造商提交WHO EUL流程申请，该EUL流程的制定旨在保障公共卫生突发事件期间所需IVD的可及性，并基于安全有效性数据等基本质量要求，协助联合国相关采购机构和成员国确定在公共卫生突发事件期间使用特定产品的可接受性。WHO提供的通道适用于全球采购，因此，《要求指南》中的临床证据部分描述了对入组说明书中声称的各类人群及各使用地区样本的要求。
FDA《检测政策》提供了灵活的加速新冠病毒检测的方式，使用经CLIA认证可开展高复杂性检测的实验室开发的试剂，在完成产品验证后、申请EUA之前(一般不超过申请之前15个工作日)，允许开展新冠病毒临床样本检测。对于州/地区授权的辖区内经CLIA认证可开展高复杂性检测的实验室，使用该实验室开发的新冠病毒检测试剂检测样本，在州/地区政府为检测结果负责的前提下，无需向FDA提交EUA申请。对于新冠病毒检测试剂生产商，在完成产品验证后、申请EUA之前(一般不超过申请之前15个工作日)，允许销售试剂给实验室进行样本检测。FDA对上述实验室或生产商开发产品的验证要求是一致的。
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质量控制措施不同
WHO EUL程序包括质量管理体系审查和上市后监管计划，以及评估试剂产品安全有效的档案审查。
我国在新冠病毒检测试剂应急审批过程中，需对申报产品进行技术审评、质量管理体系考核和上市后监管，与WHO要求一致。向WHO提交EUL程序的IVD企业必须保证其产品在适当、充分且有效的质量管理体系(QMS)下制造。因此，评估申报产品的第一步就是对制造商的QMS文档进行评估，只有在充分证明申请人是制造商且有适当的QMS证据和制造能力时，才可继续走审评流程。我国此次应急审批工作与WHO相似，在收到国家药监局转来的应急审批产品名单后，器审中心第一时间与相关企业联系，了解产品和申请人QMS情况，确认产品是否在有效的QMS条件下生产。相关省级药监局迅速启动质量管理体系核查，并将核查进度和结果反馈器审中心，《审评要点》亦强调“企业应提交在符合质量管理体系的生产环境下生产的试剂盒进行的所有性能验证的研究资料”。FDA两版指南均未提及质量管理体系相关要求。
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对于产品档案，WHO EUL程序要求提交产品描述信息以及产品安全有效性证据。对新申报产品，如未进行充分的分析和/或临床性能研究，亦可接受合理的人工样本模拟研究，在初步证据可支持产品安全有效的情况下，可不进行法规要求的全部研究。
我国在新冠病毒核酸检测试剂应急审批中，亦认可有限性证据。监管部门可在目前有一定安全有效性证据，可基本保证产品质量，但证据尚不完全充分的情况下，批准应急产品上市。
FDA签发 EUA需要的有效性证据水平为“可能有效”，低于FDA日常产品批准的“有效”标准。
WHO和我国均要求明确申报产品的主要原材料/成分信息，但WHO仅要求对其简单描述。我国则要求明确主要原材料的验证过程和质量控制标准，并将主要原材料的来源和质量控制标准在产品技术要求附录中载明，以注册证附件的形式进行固定。此外，我国要求建立稳定的企业参考品，用来进行日常生产过程中产品的半成品检验和成品检验。通过对原材料和企业参考品严格要求，保证生产原料、半成品和成品质量稳定可控。
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我国要求新冠病毒核酸检测试剂盒中应具备质控体系，包括阴性质控品、阳性质控品和内标，质控体系应参与样本处理、核酸平行提取和检测全过程，以对核酸提取和PCR扩增、试剂/设备、交叉污染等环节或关键步骤进行合理质量控制，避免检测过程中的假阴性和假阳性。WHO和FDA均未对试剂盒中的质控体系提出要求。
确保临床试验质量路径不同
各文件对检测试剂临床试验的要求也各不相同，主要体现在以下几个方面。
对临床试验机构的要求
WHO允许检测试剂的临床试验未全部完成，但其必须具有部分临床证据以确认临床性能。WHO和FDA均未对临床试验机构进行要求。
我国要求，同一检测试剂产品需在3家以上临床试验机构进行临床试验，如临床试验机构条件允许，推荐多家生产企业的试剂盒在相同的临床试验机构共同验证。
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对临床样本的要求
WHO要求，纳入各使用地区的样本应进行50个前瞻性阳性样本研究。如果前瞻性研究难以实现，亦可接受回顾性研究。应至少检测25个真实临床阳性样本，其余样本可以是由向阴性临床样本基质中添加新冠病毒制作的人工样本，临床特异性评价需要收集有症状个体的至少100份阴性样本。
考虑到阳性样本难以获取，FDA推荐实验室通过人工样本来确认检测试剂的临床性能，要求至少检测30个反应性人工样本和30个非反应性样本，反应性人工样本可以通过将RNA或灭活病毒掺入剩余临床样本中制备。对于CLIA认证实验室开发的试剂，在等待EUA申请结果的同时，FDA建议实验室采用经EUA授权的方法，对申报试剂检测的前5个阳性和前5个阴性临床样本的结果进行确认。
我国建议，检测试剂临床试验入组确诊病例不少于200例，排除病例不少于300例，检测样本可为临床样本或者经提取后的核酸提取液。由此可见，我国要求的临床试验例数更多且均要求真实临床样本，所获得的临床证据更加真实和充分。
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对临床试验入组人群的要求
WHO要求，检测试剂的临床试验应纳入说明书声称的各类人群，但是未具体描述适用人群的概念和范围。我国明确适用人群为新冠肺炎疑似病例，要求入组确诊和排除病例均应有一定例数，包括部分前期核酸检测阴性的确诊病例、解除隔离和符合出院标准的病例，入组病例应包括不同临床严重程度、不同病程阶段的患者。
由此可见，我国要求的临床试验入组人群更加具体和全面，覆盖了产品在实际临床应用中的所有情况。FDA未对临床评价入组人群进行要求。
对临床试验对比方法的要求
WHO推荐的临床试验对比方法为：对于临床样本，将检测试剂与FDA EUA或WHO EUL 列出的PCR检测进行对比；对于人工样本，将检测试剂结果与预期结果进行比较。FDA要求的临床证据来自于人工样本和CLIA认证实验室在等待EUA申请结果时检测的10个临床样本。其中，人工样本的试剂检测结果应与其预期结果进行比较，临床样本的试剂检测结果应采用经EUA授权的方法进行确认。如果任何一个结果不符合要求，实验室应通知FDA，并且采取其他合适的措施，如终止检测患者样本，并发布声称之前检测结果可能无效的更正测试报告。
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我国要求，新冠病毒核酸检测试剂临床试验应选择已上市的同类产品作为对比产品，同时结合试剂检测结果与临床确诊/排除结果进行综合对比。其中，临床确诊病例应依据国家卫健委发布的新冠病毒感染病例确认程序判定，不建议采用某一试验地点的单次试验结果作为确认结果。由此可见，我国要求的临床试验对比方法综合对比试剂和感染病例确认程序，结果更加准确。
对临床试验结果统计分析的要求
WHO和FDA对临床结果的统计分析，仅要求计算一致性百分比。我国要求的统计分析对结果数据的挖掘更加充分，具体分析内容包括试剂符合率、临床灵敏度、临床特异性及其置信区间，人口学分析，不同人群的分层统计，不同样本类型的分别分析以及不一致结果分析。
(注：本文所引相关文件的更新日期截止到2020年3月25日)
(作者单位：国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心)
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确保IVD检测结果真实可靠(下) ——中国、美国及WHO新冠病毒核酸检测试剂审评要求简要对比
□ 李红然 董劲春
性能指标有所不同
中国、美国及WHO新型冠状病毒核酸检测试剂审评对于检测试剂性能的要求各不相同，主要体现在以下几个方面。
核酸提取/纯化性能
WHO和FDA均未对检测试剂配套提取试剂的性能提出要求。新冠病毒属于RNA病毒，需要提取分离得到RNA方可检测，且由于采集样本常为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等，可能存在病毒载量低、PCR抑制物影响反应进行等问题，因此，提取并富集目的核酸，纯化去除PCR抑制物尤为重要。我国要求对配合检测试剂使用的核酸提取/纯化试剂的提取效率、提取核酸纯度等指标做充分验证，以确保检测反应顺利进行和反应体系可控。但是对于特殊方法学的产品，如果试验设计无核酸提取步骤，在性能验证充分且符合要求的情况下，也可以获得批准。
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病毒样本包容性验证
目前，研究发现新冠病毒已产生百余个突变位点，如果检测试剂引物探针结合位置的核酸序列发生突变，可能会影响检测结果。对此，我国要求在引物、探针设计阶段，应通过序列比对和试验等方式，对病毒进行包容性和特异性(比如交叉反应)评价，选择最佳的引物探针组合。在性能评估中，应至少验证具有时间和区域特征的10个不同来源病毒样本，以尽量证明检测试剂可以检测不同病毒株。FDA仅要求采用计算机序列比对方式分析包容性，未要求通过真实病毒进行试验验证。WHO对包容性相关序列分析和试验验证均未进行要求。
精密度评价方法
我国对检测试剂精密度评价提出了要求，明确应采用若干临床样本进行精密度评价，不可仅采用模拟样本，精密度评价试验应包含核酸分离/纯化步骤。此外，我国还设置了各样本的精密度评价标准，通过明确具体要求，确保精密度验证的充分性。WHO未提出上述要求，仅概括性地描述了精密度的影响因素和样本浓度水平。FDA指南未提及对精密度的要求。
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计量学溯源性
WHO表示，目前尚无新冠病毒核酸检测国际标准品，一旦建立相关国际标准品(IS)或参考物质，应根据已建立的IS或参考物质对试剂进行校准。目前，试剂应溯源至经验证的新冠病毒检测参考物质。WHO要求制造商参加合作研究，以评估临时性IS。
我国的相关要求与WHO基本一致，在审评过程中，要求采用科学的方法标定病毒滴度，进行最低检出限相关的量值研究。中国食品药品检定研究院建立了应急用国家参考品，可评估各申报试剂的相对灵敏度，但并未对参考品进行定值，所得结果仅可体现各申报试剂的平行比对信息，无法体现病毒量值。目前我国批准的新冠病毒核酸检测试剂均为定性检测试剂。FDA指南未提及量值研究。
最低检出限研究方法
我国和WHO、FDA对检测试剂最低检出限研究方法的要求基本一致，均为采用梯度稀释，多次重复测定获得具有95%阳性检出率的浓度水平。不同的是，WHO允许使用体外转录或装甲RNA等模拟样本进行最低检出限研究，未要求必须使用病毒样本或核酸提取液作为样本；FDA指南接受采用RNA或灭活病毒掺入人工基质或真实临床样本基质制成的样本，但是未表示接受体外转录或装甲RNA等模拟被测物；我国要求至少采用不同来源的3个具有代表性的新冠病毒样本或假病毒，以及另外3个不同真实临床样本或核酸提取液，分别进行最低检出限确定和验证。
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如果同一检测试剂适用多种基质样本类型，FDA推荐制造商在EUA申请中仅提交其采用最具挑战性临床基质进行的最低检出限研究结果。例如，若试剂可检测痰液、支气管肺泡灌洗液、鼻咽拭子等呼吸道样本，制造商应仅提交痰液样本的最低检出限结果。我国和WHO均要求，对于每种声称适用的样本类型，均应进行最低检出限研究。相比FDA，我国和WHO的要求更加严格。
特异性分析方法
WHO要求，对于常规PCR检测试剂或者测试前使用完善的提取方法提取的试剂，检测呼吸道或血浆样本时可不进行干扰研究；对于新的提取方法或等温扩增等非常规PCR产品，需要对潜在的干扰物进行测试。考虑到RNA逆转录酶比DNA聚合酶更易受到其他物质干扰，为充分发现潜在干扰物质，我国要求所有检测试剂均应进行干扰研究。
对于推荐研究的潜在干扰物质种类，WHO和我国基本一致，但是WHO仅描述了干扰物质的类别，而我国列举出了干扰物质类别和具体物质/活性成分，有利于申请人执行该要求，保持审评尺度一致。对于推荐研究的交叉反应物质，WHO和我国要求的病原体大部分相同，但亦各自存在不同的病原体，这可能与不同地区出现的感染病原体种类不同有关。值得一提的是，我国明确要求了交叉病原体种类和具体型别，且种类相对较多，有利于确保验证的充分性。
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适用机型评估资料提交
由于新冠病毒核酸检测试剂需要采用实时荧光定量PCR仪进行检测，不同厂家和型号的仪器存在差异，可能会导致实验条件和扩增效率不同。因此，我国要求对于适用于多个机型的试剂，产品说明书【适用机型】项中应列出所有型号仪器的性能评估资料。
WHO和FDA对性能评估的要求均未考虑机型因素。
样本性能评估项目
WHO要求，应对每种样本类型(例如不同的拭子类型或病毒转运介质等)进行基质等效性研究及最低检出限和临床特异性研究。
我国规定，不同样本类型应分别进行性能评估验证。一般来说，我国要求的不同样本类型为咽拭子、痰液和肺泡灌洗液等，在最小负担原则的前提下，并未要求对不同拭子及转运介质进行全性能评估。
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FDA指南并未考虑不同样本类型和基质的验证，仅表示在最低检出限研究中应采用最具挑战性临床基质进行试验。
阳性判断值设置
阳性判断值指通过试剂检测结果判断样本是否达到病毒核酸的临界Ct值，是检测结果的判断依据，阳性判断值设置合适与否，直接关系到是否会出现假阳性或假阴性结果。我国要求提交阳性判断值确定资料，并对该研究提出了具体要求。WHO和FDA均未要求提交该资料。
样本及试剂稳定性研究
WHO要求，在不同条件下，应至少测试10个样本的稳定性。因为考虑样本稳定性属共性特征，与样本例数关系不大，我国并未要求样本稳定性研究的例数。
WHO和我国均要求进行试剂稳定性研究，如果时间有限，可提交尚未完成的实时稳定性试验资料，资料中应包含研究计划和当前的研究结果。企业应在产品上市后继续完成实时稳定性研究。
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主要生产工艺研究资料提交
我国需提交确定产品主要生产工艺的研究资料，同时提供反应体系的详细研究资料，以评价产品生产和使用过程的科学性。WHO和FDA均未要求提交该资料。
检测能力描述方式
WHO要求提交检测能力相关资料，描述申报产品的样本通量/容量、执行检测所需的时间(从临床样本采集到获得检测结果)，以及每台仪器每天可进行的检测次数。器审中心与企业沟通时，均会了解产品测试通量和速度等信息，但是未将该内容写入审评要点，未将其作为申报资料的一部分进行提交。在疫情防控的紧急状态下，将审评资源集中在通量高、速度快、易于推广应用的产品上，是更加科学高效的选择。
综上所述，我国对新冠病毒核酸检测试剂的要求比较充分和明确，在疫情防控应急状态下，接受有限的证据，但在可实现的情况下，要求产品的安全有效性证据尽量充分。此外，我国的检测试剂审评要点要求更加细化，不仅有利于申请人在产品验证确认过程中一步到位，不走弯路，还有利于审评尺度保持一致。同时，我们也注意到，国际监管机构在某些方面具有先进经验，值得我们学习和借鉴。
(注：本文所引参考文献截止到2020年3月25日)
(作者单位：国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心)
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