慢性阻塞性肺病患者低氧呼吸驱动降低的遗传学初步研究
季蓉 何权瀛 张荣葆 高占成 丁东杰
摘 要 目的 观测慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)Ⅱ型呼吸衰竭患者及其子女呼吸中枢对低氧的反应性，并对低氧呼吸驱动与微卫星位点的关系进行连锁分析，初步探讨其低氧呼吸驱动反应性降低的基因是否与染色体6q21.1-21.2区域的某一位点相连锁。方法 测定6例COPDⅡ型呼吸衰竭患者及其21名子女呼吸中枢驱动对低氧的反应性ΔP0.1/ΔSaO2、ΔVE/ΔSaO2，同时对位于第6号染色体短臂上的5个微卫星位点D6S299、D6S1691、D6S276、D6S1701、D6S1629进行扩增片段长度多态性检验，用LINKAGE遗传统计软件进行连锁分析。结果 受检患者的10名子女低氧呼吸驱动反应性降低，而另11名子女则正常，两组子女的性别分布均等；低氧呼吸驱动反应性降低性状与各微卫星位点的连锁分析结果显示，最大Lod值在D6S276位点为1.74(θ=0.10)。结论 低氧呼吸驱动反应性降低可能受遗传因素的影响，且遗传方式符合常染色体显性遗传；致低氧呼吸驱动反应性降低的基因与D6S276位点紧密连锁。
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关键词：慢性阻塞性肺病Ⅱ型呼吸衰竭；低氧呼吸驱动反应性；微卫星位点；连锁分析
慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种具有复杂基因基础的疾病。我们以前的研究表明Ⅱ型呼吸衰竭患者的低氧呼吸驱动反应性降低，并且可以影响子代的低氧呼吸驱动反应性。与HLA的遗传连锁分析发现，COPDⅡ型呼吸衰竭患者与其低氧呼吸驱动反应性降低的子女共享某个HLA异常单体型，但未发现与之相关的HLA位点，进一步在第6号染色体短臂上选择遗传标志进行连锁分析，在D6S276位点，当θ=0.00时，Lods=2.924，提示可能存在低氧呼吸驱动反应性的遗传易感性基因，而且这一基因距D6S276位置较近，并可能是COPD患者二氧化碳潴留的易感基因，Ⅱ型呼吸衰竭患者该基因异常，并可遗传给子女[1]。为了进一步确定这一遗传倾向，探讨这一遗传基因的位置，我们以D6S276为中心，在其邻近2～4 cM选择遗传标志，测定了6个COPDⅡ型呼吸衰竭患者家系低氧驱动反应性，并对COPD患者低氧呼吸驱动降低的易感基因进行初步定位。
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1 对象与方法
1.1 研究对象 (1)正常对照组：34人，经询问病史和体检证实均无呼吸系统疾病，其中男23人，女11人。(2)多态性人群：由100名无血缘关系、无COPD家族史的北京地区汉族人群组成，其中男56名，女44名，平均年龄45±9岁。(3)COPDⅡ型呼吸衰竭家系：6例Ⅱ型呼吸衰竭患者来自我院呼吸科门诊及住院患者，测试时处于临床稳定期，血气分析PaO2<60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，PaCO2>50 mmHg，其子女共21人，所有患者子女均身体健康。
1.2 低氧呼吸驱动反应性的测定 采用国际统一标准的重复呼吸法[2]。观察P0.1、SaO2、VE，通过直线回归计算ΔP0.1/ΔSaO2、ΔVE/SaO2。
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1.3 实验步骤 (1)基因组DNA提取。(2)聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)：各微卫星位点位置及其杂合率、等位基因数目、PCR条件及扩增片段长度范围经查询Internet Gene Bank获得(表1)。PCR产物鉴定：取上述PCR产物5 μl，加1 μl 6×上样缓冲液混匀，加样于2%琼脂糖凝胶，以1×TAE作电泳缓冲液，80 V电压电泳20 min，紫外灯下观察产物是否存在。(3)微卫星多态性及家系成员基因型检测：采用质量分数为6%的变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶灌入测序级电泳槽(Bio-Rad)，上、下电泳缓冲液均为1×TBE。电压2000 V，功率55 W，预电泳约2 h，使凝胶表面温度达50 ℃。将PCR产物加入2×变性上样缓冲液，沸水煮5 min变性后立即置于冰浴，每孔样5～6 μl，电泳时间3 h。电泳后进行硝酸银染色[3]。(4)读取基因型：将等位基因按从大到小的顺序，以序数命名。上
表1 各微卫星位点位置及特征
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Table 1 Loci and characteristics of the microsatellites
Loci of
micro-
satellites
(微卫星
位点)
Symbol
(代号)
Interval from
D6S276
(距D6S276
, http://www.100md.com
距离)(cM)
Allele
number
(等位基因
数目)
Heterozy-
gosity
(杂合率)
(%)
Fragment
length
(片段长度)
, http://www.100md.com (bp)
D6S299
A
3.6
8
79
206-226
D6S1691
B
2.2
15
85
213-251
, http://www.100md.com
D6S276
C
0
11
83
206-226
D6S1701
D
2.7
8
76
227-251
D6S1629
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E
3.5
6
78
219-237
1.4 统计学分析 患者及子女组与对照组呼吸驱动同一指标的对比分析采用SPSS统计软件包进行t检验。人群中各微卫星位点的多态性分布采用χ2检验确定是否符合Hardy-Weinberg平衡，χ2=(期望值-观察值)2/期望值。采用LINKAGE软件包(V5.22)中的MLINK程序计算Lods值。
2 结果
2.1 患者及其子女血气及肺功能状况 对6个家系共6例患者及其21名子女进行了动脉血气分析和肺功能检查(表2)。患者组的气道阻塞程度显著高于子女组，其低氧和二氧化碳潴留程度符合Ⅱ型呼吸衰竭。
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表2 患者及子女一般情况、肺功能、动脉血气测定(
±s)
Table 2 The clinical status of the patients and their offsprings
Clinical status
(临床指标)
Patients
(患者组)
Offsprings
(子女组)
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P value
(P值)
Male/Female(cases)
(男/女)
4/2
9/12
Age(years)〔年龄(岁)〕
70.00
±2.20
39.9
±5.60
<0.01
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FEV1/FVC(%)
(第1秒呼气量)
46.38
±5.25
86.94
±8.42
<0.01
pH(pH值)
7.37
±0.04
7.41
±0.07
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>0.10
PaO2(mmHg)
(动脉血氧分压)
53.90
±14.01
89.57
±8.09
<0.05
PaCO2(mmHg)
(动脉血二氧化碳分压)
61.18
±10.26
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37.99
±4.93
<0.05
2.2 低氧呼吸驱动反应性 患者组ΔP0.1/ΔSaO2绝对值(-0.05±0.01)明显小于子女组(0.15±0.07)和正常对照组(-0.19±0.08)(P<0.05)，而患者组ΔVE/ΔSaO2(-0.71±0.70)与其子女组(-0.78±0.58)及正常对照组(-0.56±0.21)的差异无统计学意义(P>0.1)。
正常人群ΔP0.1/ΔSaO2=-0.19±0.08，ΔP0.1/ΔSaO2正常范围为(95%可信限)-0.11～-0.27，以ΔP0.1/ΔSaO2绝对值小于0.11作为判定低氧呼吸驱动降低标准，则21名子女中共有10名子女ΔP0.1/ΔSaO2绝对值低于0.11，即其低氧呼吸驱动反应性降低，另11名子女ΔP0.1/ΔSaO2绝对值大于0.11，低氧呼吸驱动反应性正常；两者差异显著(P<0.05)，而前者的ΔP0.1/ΔSaO2、ΔVE/ΔSaO2与患者组比较差异无显著性意义(表3)。
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2.3 各微卫星位点分布及其与低氧呼吸驱动反应性的连锁分析
2.3.1 北京地区中国人可变数目串联重复序列(variable number tandem repeat, VNTR)各位点频率及杂合率 等位片段在群体中显示出多态现象。由于扩增片段中两条变性解开的链AC、GT含量不等，造成在变性聚丙烯酰胺凝胶中泳动率不同，所以纯合子产生2条带，杂合子产生4条带(图1，2)。各微卫星位点基因数目和杂合率如表4所示。Hardy-Weinberg平衡检验：D6S299：χ2=2.95，υ=9，P>0.5；D6S1691：χ2=14.97，υ＝35，P>0.5；D6S276：χ2=19.7，υ=18，P>0.5；D6SA1701：χ2=16.24，υ=12，P>0.5；D6S1629：χ2=4.59，υ=11，P>0.5；均符合Hardy-Weinberg平衡。 表3 COPD患者及其子女低氧呼吸驱动反应性及血气、肺功能的比较(±s)
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Table 3 Ventilation and P0.1 response to hypoxia and clinical status of the patients and their offsprings(±s)
Item(项目)
Patients
(患者组)(n=6,a)
Depressed response group
(低氧驱动下降子女)(n=10,b)
Normal response group
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(低氧驱动正常子女)(n=11,c)
P value(P值)
a∶b
a∶c
b∶c
ΔP0.1/ΔSaO2
(低氧中枢驱动反应性)
-0.05±0.01
-0.05±0.03
-0.23±0.14
>0.10
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<0.05
<0.01
ΔVE/ΔSaO2
(低氧通气驱动反应性)
-0.71±0.70
-0.35±0.23
-0.91±0.67
>0.10
>0.10
<0.05
Male/Female(cases)
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(男/女)
4/2
4/6
5/6
FEV1/FVC
(第一秒呼气量)
46.38±5.25
85.35±9.07
88.69±7.73
<0.01
<0.01
>0.10
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PaO2(动脉血氧分压)
53.90±14.01
87.53±10.13
91.35±5.94
<0.05
<0.01
>0.10
PaCO2
(动脉血二氧化碳分压)
61.18±10.26
36.63±4.70
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39.19±5.11
<0.05
<0.05
>0.10
2.3.2 连锁分析 各微卫星位点与低氧呼吸驱动反应性降低性状的连锁分析，在假设疾病为常染色体显性遗传模式，外显率为100%，发病率为10-5情况下，应用LINKGE软件MLINK程序进行两点连锁分析，Lods值统计见表5。
3 讨论
3.1 Ⅱ型呼吸衰竭患者及子女低氧呼吸驱动反应性COPDⅡ型呼吸衰竭患者组低氧呼吸驱动显著低于正常对照组，与文献报道及我们以前的研究结果一致[1，4]。家系研究的结果表明Ⅱ型呼吸衰竭患者的子女中，部分子女低氧呼吸驱动降低，且这部分子女并不存在气道阻塞、呼吸肌衰竭及神经肌肉疾患，亦无高原生活史，不存在低氧适应所致的低氧反应性下降，因此其低氧反应性下降的原因可能主要受遗传因素的影响，与文献所述COPD患者低氧反应性下降具有家族聚集性，显示出其遗传效应的结论相一致，并除外了α1-AT缺陷的可能[5-7]。患者组的ΔP0.1/ΔSaO2显著低于低氧反应正常子女组，而与低氧反应降低组子女组无显著差异。虽然患者组、子女组ΔVE/ΔSaO2与对照组无显著差异，但ΔP0.1/ΔSaO2降低子女的ΔVE/ΔSaO2显著低于ΔP0.1/ΔSaO2正常组，而这两组子女的动脉血气、肺功能均正常，具有可比性。P0.1仅反应吸气驱动水平，而VE则同时受吸气和呼气过程的影响以及不同研究对象气道阻力等机械因素的影响，因此，二者对低氧的反应性并不一定十分相关。COPD患者的部分健康子女低氧反应性下降提示遗传因素在低通气发生中可能起着一定作用。
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图1 D6S1629位点(a)、D6S276位点(b)和D6S1791位点(c)的基因型多态性分布 E为D6S1629的代号；C为D6S276的代号；D为D6S1701的代号；序数表示扩增的等位基因片段从大到小的顺序 图2家系2 D6S1701位点的基因型 Ⅰ代表第1代；Ⅱ1～Ⅱ5代表Ⅰ1的5个子女
Fig 1 Genotypes of D6S1629(a), D6S276(b),and D6S1701(c) E：the symbol of D6S1629；C：the symbol of D6S276；D：the symbol of D6S1701； ordinal number from large to small is in accordance to the length of PCR products Fig 2 Genotype of D6S1701 in family 2 Ⅰ represents the first generation, Ⅱ1-Ⅱ5 represent the five offsprings of Ⅰ1
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表4 各位点等位基因及杂合率
Table 4 Observed allele number and heterozygosity of microsatellites
Characteristics of alleles
(等位基因性状)
Loci of microsatellites(微卫星位点)
D6S299
D6S1691
D6S276
D6S1701
D6S1629
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Observed allele number(等位基因数)
8
12
9
8
6
Heterozygosity(%)(杂合率)
74.5
80.8
78.9
70.2
60
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表5 连锁分析的重组率及Lods值
Table 5 Recombination rate and Lod score
Loci of
microsatellites
(微卫星位点)
Recombination rates(重组率)(θ)
Max(θ)
(最大Lod值)
0.00
0.01
0.05
, 百拇医药
0.10
0.20
0.30
0.40
D6S299
-∞
-4.73
-2.09
-1.09
-0.32
-0.01
-0.00
0.00(0.40)
, 百拇医药
D6S1691
-∞
-5.54
-2.28
-1.07
-0.20
0.03
0.03
0.03(0.30)
D6S276
-∞
0.44
1.53
, 百拇医药
1.74
1.49
0.92
0.31
1.74(0.10)
D6S1701
-∞
-0.81
-0.19
0.02
0.12
0.09
0.03
, 百拇医药
0.12(0.20)
D6S1629
-∞
-6.42
-3.07
-1.75
-0.65
-0.21
0.03
0.03(0.40)
尽管肺功能受损、气流阻力增高在COPD发生Ⅱ型呼吸衰竭的过程中起着重要作用，但肺功能与通气量之间并无明确的相关性，临床上观察到具有相同气道阻塞程度的COPD患者，有的出现二氧化碳潴留，有的不出现。因此，COPD发生Ⅱ型呼吸衰竭的原因除了COPD本身的病理因素之外，其呼吸中枢反应性的异常也是造成低氧、二氧化碳潴留的原因。我们的研究表明，COPD患者低氧呼吸驱动降低可能是其发生呼吸衰竭的原因之一，而且这一缺陷可以遗传给子代，使之对低氧的反应性也降低。
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3.2 连锁分析结果 家系分析表明，低氧呼吸驱动反应性降低呈显性症状，且在连续两代出现，患者为杂合子，亲代一方低氧反应性降低，子女低氧反应性降低的概率近1/2，男女患病机会均等，符合外显完全的常染色体显性遗传方式。
我们曾于1993～1996年间对COPDⅠ型呼吸衰竭和Ⅱ型呼吸衰竭患者的家系进行低氧和高二氧化碳呼吸驱动的研究[1]，证明Ⅱ型呼吸衰竭患者的子女部分低氧反应性降低，并与D6S276呈连锁关系。此次我们以D6S276为中心，选择了附近5个微卫星标志进行分析，结果证实了在部分子女中确实存在低氧呼吸驱动降低，支持低氧呼吸驱动的遗传性。各个微卫星位点在大约100名北京地区中国人、200条染色体上的分布具有较高的多态性。家系中大多数个体多态性的位点为杂合，能够提供信息。通过核心家系连锁分析，与致病基因间连锁的最大Lod值为D6S276：1.74(θ=0.10)，支持致低氧反应性降低的基因与D6S276紧密连锁，与我们原先的结论一致[1]。原家系分析与D6S276连锁的Lod值=2.924，θ=0，造成连锁分析的Lod值反而降低的原因可能在于：(1)实验方法不同：我们原先采用的虽然也是Amp-FLP方法，但电泳是用小型垂直电泳槽进行的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，而且未进行各微卫星位点的多态性分析，仅对家系成员的标本进行分析。由于电泳分辨率不够高，5个家系中最终用于连锁分析的有效家系仅3家。实验方法的不同可能在识读基因型时产生系统误差，影响最后统计结果。(2)统计方法不同：两次实验结果虽然都采用的是Lods法，但由于前次实验无各位点多态性资料，也无法判断家系成员标本的具体基因型，故只有依靠查表法计算Lod值。查表法忽略了基因频率、外显率、发病率等因素，往往使Lod值较实际情况有所升高，目前已多不采用。
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COPD属于晚发病，发病年龄一般在40岁以后，待发生Ⅱ型呼吸衰竭年龄就更迟一些，此时患者的父母可能已经去世，而子代尚未发病，同时呼吸驱动在老年人(第1代)和少儿组(第3代)的测定结果还存在差异，因此，同时有3代以上成员的家系资料很难收集。也正是由于这一原因，使COPD的遗传学研究进展缓慢。目前，许多学者认为当前对于COPD有待研究的重要课题主要是鉴别与COPD有关的生化、遗传和分子标志物，特别应强调的是需查明与易感性有关的遗传学因子和其它宿主因子[8]。我们仅从呼吸驱动的角度探讨了COPD发生Ⅱ型呼吸衰竭的遗传学因素，对于COPD这一广泛领域来说，还有许多方面有待于进一步研究和探索。
基金项目：国家自然科学基金(39770337)
通信作者：季蓉(E-mail:jir@hotmail.com)
作者单位：季蓉(100044 北京医科大学人民医院呼吸科)
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何权瀛(100044 北京医科大学人民医院呼吸科)
张荣葆(100044 北京医科大学人民医院呼吸科)
高占成(100044 北京医科大学人民医院呼吸科)
丁东杰(100044 北京医科大学人民医院呼吸科)
参考文献
[1]Zhang RB, Ding DJ, Cheng ErZH, et al. A study on the genetic factor in the development of carbon dioxide retention in chronic obstructive pulmonary disease patients with respiratory failure. Chin J Intern Med, 1998, 37∶749-752.[张荣葆，丁东杰，陈尔璋，等.对慢性阻塞性肺病呼吸衰竭患者二氧化碳潴留机制的探讨.中华内科杂志，1998，37∶749-752].
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[2]Rebuck AS, Campbell EJM. A clinical method for assessing the ventilatory response to hypoxia. Am Rev Respir Dis, 1974, 109∶345-350.
[3]Bassam BJ, Caetamo-Anollis G, Gresshoff PM. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem, 1991, 196∶80-83.
[4]Kepron W, Chemiack RM. The ventilatory response to hypercapnia and to hypoxemia in chronic obstructive lung disease. Am Rev Respir Dis, 1973, 108∶843.
, 百拇医药
[5]Moore GC, Zwillich CW, Battaglia JD, et al. Respiratory failure associated with familial depression of ventilatory response to hypoxia and hypercapnia. N Engl J Med, 1978, 295∶861-865.
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[8]Petty TL, Weinmann GG. Building a national strategy for the prevention and management of and research in chronic obstructive pulmonary disease. National Heart, Lung, and Blood Institute workshop summary. JAMA, 1997, 277∶246-253., http://www.100md.com
摘 要 目的 观测慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)Ⅱ型呼吸衰竭患者及其子女呼吸中枢对低氧的反应性，并对低氧呼吸驱动与微卫星位点的关系进行连锁分析，初步探讨其低氧呼吸驱动反应性降低的基因是否与染色体6q21.1-21.2区域的某一位点相连锁。方法 测定6例COPDⅡ型呼吸衰竭患者及其21名子女呼吸中枢驱动对低氧的反应性ΔP0.1/ΔSaO2、ΔVE/ΔSaO2，同时对位于第6号染色体短臂上的5个微卫星位点D6S299、D6S1691、D6S276、D6S1701、D6S1629进行扩增片段长度多态性检验，用LINKAGE遗传统计软件进行连锁分析。结果 受检患者的10名子女低氧呼吸驱动反应性降低，而另11名子女则正常，两组子女的性别分布均等；低氧呼吸驱动反应性降低性状与各微卫星位点的连锁分析结果显示，最大Lod值在D6S276位点为1.74(θ=0.10)。结论 低氧呼吸驱动反应性降低可能受遗传因素的影响，且遗传方式符合常染色体显性遗传；致低氧呼吸驱动反应性降低的基因与D6S276位点紧密连锁。
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关键词：慢性阻塞性肺病Ⅱ型呼吸衰竭；低氧呼吸驱动反应性；微卫星位点；连锁分析
慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种具有复杂基因基础的疾病。我们以前的研究表明Ⅱ型呼吸衰竭患者的低氧呼吸驱动反应性降低，并且可以影响子代的低氧呼吸驱动反应性。与HLA的遗传连锁分析发现，COPDⅡ型呼吸衰竭患者与其低氧呼吸驱动反应性降低的子女共享某个HLA异常单体型，但未发现与之相关的HLA位点，进一步在第6号染色体短臂上选择遗传标志进行连锁分析，在D6S276位点，当θ=0.00时，Lods=2.924，提示可能存在低氧呼吸驱动反应性的遗传易感性基因，而且这一基因距D6S276位置较近，并可能是COPD患者二氧化碳潴留的易感基因，Ⅱ型呼吸衰竭患者该基因异常，并可遗传给子女[1]。为了进一步确定这一遗传倾向，探讨这一遗传基因的位置，我们以D6S276为中心，在其邻近2～4 cM选择遗传标志，测定了6个COPDⅡ型呼吸衰竭患者家系低氧驱动反应性，并对COPD患者低氧呼吸驱动降低的易感基因进行初步定位。
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1 对象与方法
1.1 研究对象 (1)正常对照组：34人，经询问病史和体检证实均无呼吸系统疾病，其中男23人，女11人。(2)多态性人群：由100名无血缘关系、无COPD家族史的北京地区汉族人群组成，其中男56名，女44名，平均年龄45±9岁。(3)COPDⅡ型呼吸衰竭家系：6例Ⅱ型呼吸衰竭患者来自我院呼吸科门诊及住院患者，测试时处于临床稳定期，血气分析PaO2<60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，PaCO2>50 mmHg，其子女共21人，所有患者子女均身体健康。
1.2 低氧呼吸驱动反应性的测定 采用国际统一标准的重复呼吸法[2]。观察P0.1、SaO2、VE，通过直线回归计算ΔP0.1/ΔSaO2、ΔVE/SaO2。
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1.3 实验步骤 (1)基因组DNA提取。(2)聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)：各微卫星位点位置及其杂合率、等位基因数目、PCR条件及扩增片段长度范围经查询Internet Gene Bank获得(表1)。PCR产物鉴定：取上述PCR产物5 μl，加1 μl 6×上样缓冲液混匀，加样于2%琼脂糖凝胶，以1×TAE作电泳缓冲液，80 V电压电泳20 min，紫外灯下观察产物是否存在。(3)微卫星多态性及家系成员基因型检测：采用质量分数为6%的变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶灌入测序级电泳槽(Bio-Rad)，上、下电泳缓冲液均为1×TBE。电压2000 V，功率55 W，预电泳约2 h，使凝胶表面温度达50 ℃。将PCR产物加入2×变性上样缓冲液，沸水煮5 min变性后立即置于冰浴，每孔样5～6 μl，电泳时间3 h。电泳后进行硝酸银染色[3]。(4)读取基因型：将等位基因按从大到小的顺序，以序数命名。上
表1 各微卫星位点位置及特征
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Table 1 Loci and characteristics of the microsatellites
Loci of
micro-
satellites
(微卫星
位点)
Symbol
(代号)
Interval from
D6S276
(距D6S276
, http://www.100md.com
距离)(cM)
Allele
number
(等位基因
数目)
Heterozy-
gosity
(杂合率)
(%)
Fragment
length
(片段长度)
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D6S299
A
3.6
8
79
206-226
D6S1691
B
2.2
15
85
213-251
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D6S276
C
0
11
83
206-226
D6S1701
D
2.7
8
76
227-251
D6S1629
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E
3.5
6
78
219-237
1.4 统计学分析 患者及子女组与对照组呼吸驱动同一指标的对比分析采用SPSS统计软件包进行t检验。人群中各微卫星位点的多态性分布采用χ2检验确定是否符合Hardy-Weinberg平衡，χ2=(期望值-观察值)2/期望值。采用LINKAGE软件包(V5.22)中的MLINK程序计算Lods值。
2 结果
2.1 患者及其子女血气及肺功能状况 对6个家系共6例患者及其21名子女进行了动脉血气分析和肺功能检查(表2)。患者组的气道阻塞程度显著高于子女组，其低氧和二氧化碳潴留程度符合Ⅱ型呼吸衰竭。
, 百拇医药
表2 患者及子女一般情况、肺功能、动脉血气测定(
±s)Table 2 The clinical status of the patients and their offsprings
Clinical status
(临床指标)
Patients
(患者组)
Offsprings
(子女组)
, http://www.100md.com
P value
(P值)
Male/Female(cases)
(男/女)
4/2
9/12
Age(years)〔年龄(岁)〕
70.00
±2.20
39.9
±5.60
<0.01
, http://www.100md.com
FEV1/FVC(%)
(第1秒呼气量)
46.38
±5.25
86.94
±8.42
<0.01
pH(pH值)
7.37
±0.04
7.41
±0.07
, 百拇医药
>0.10
PaO2(mmHg)
(动脉血氧分压)
53.90
±14.01
89.57
±8.09
<0.05
PaCO2(mmHg)
(动脉血二氧化碳分压)
61.18
±10.26
, 百拇医药
37.99
±4.93
<0.05
2.2 低氧呼吸驱动反应性 患者组ΔP0.1/ΔSaO2绝对值(-0.05±0.01)明显小于子女组(0.15±0.07)和正常对照组(-0.19±0.08)(P<0.05)，而患者组ΔVE/ΔSaO2(-0.71±0.70)与其子女组(-0.78±0.58)及正常对照组(-0.56±0.21)的差异无统计学意义(P>0.1)。
正常人群ΔP0.1/ΔSaO2=-0.19±0.08，ΔP0.1/ΔSaO2正常范围为(95%可信限)-0.11～-0.27，以ΔP0.1/ΔSaO2绝对值小于0.11作为判定低氧呼吸驱动降低标准，则21名子女中共有10名子女ΔP0.1/ΔSaO2绝对值低于0.11，即其低氧呼吸驱动反应性降低，另11名子女ΔP0.1/ΔSaO2绝对值大于0.11，低氧呼吸驱动反应性正常；两者差异显著(P<0.05)，而前者的ΔP0.1/ΔSaO2、ΔVE/ΔSaO2与患者组比较差异无显著性意义(表3)。
, 百拇医药
2.3 各微卫星位点分布及其与低氧呼吸驱动反应性的连锁分析
2.3.1 北京地区中国人可变数目串联重复序列(variable number tandem repeat, VNTR)各位点频率及杂合率 等位片段在群体中显示出多态现象。由于扩增片段中两条变性解开的链AC、GT含量不等，造成在变性聚丙烯酰胺凝胶中泳动率不同，所以纯合子产生2条带，杂合子产生4条带(图1，2)。各微卫星位点基因数目和杂合率如表4所示。Hardy-Weinberg平衡检验：D6S299：χ2=2.95，υ=9，P>0.5；D6S1691：χ2=14.97，υ＝35，P>0.5；D6S276：χ2=19.7，υ=18，P>0.5；D6SA1701：χ2=16.24，υ=12，P>0.5；D6S1629：χ2=4.59，υ=11，P>0.5；均符合Hardy-Weinberg平衡。 表3 COPD患者及其子女低氧呼吸驱动反应性及血气、肺功能的比较(
±s), 百拇医药
Table 3 Ventilation and P0.1 response to hypoxia and clinical status of the patients and their offsprings(
±s)Item(项目)
Patients
(患者组)(n=6,a)
Depressed response group
(低氧驱动下降子女)(n=10,b)
Normal response group
, 百拇医药
(低氧驱动正常子女)(n=11,c)
P value(P值)
a∶b
a∶c
b∶c
ΔP0.1/ΔSaO2
(低氧中枢驱动反应性)
-0.05±0.01
-0.05±0.03
-0.23±0.14
>0.10
, http://www.100md.com
<0.05
<0.01
ΔVE/ΔSaO2
(低氧通气驱动反应性)
-0.71±0.70
-0.35±0.23
-0.91±0.67
>0.10
>0.10
<0.05
Male/Female(cases)
, http://www.100md.com
(男/女)
4/2
4/6
5/6
FEV1/FVC
(第一秒呼气量)
46.38±5.25
85.35±9.07
88.69±7.73
<0.01
<0.01
>0.10
, 百拇医药
PaO2(动脉血氧分压)
53.90±14.01
87.53±10.13
91.35±5.94
<0.05
<0.01
>0.10
PaCO2
(动脉血二氧化碳分压)
61.18±10.26
36.63±4.70
, 百拇医药
39.19±5.11
<0.05
<0.05
>0.10
2.3.2 连锁分析 各微卫星位点与低氧呼吸驱动反应性降低性状的连锁分析，在假设疾病为常染色体显性遗传模式，外显率为100%，发病率为10-5情况下，应用LINKGE软件MLINK程序进行两点连锁分析，Lods值统计见表5。
3 讨论
3.1 Ⅱ型呼吸衰竭患者及子女低氧呼吸驱动反应性COPDⅡ型呼吸衰竭患者组低氧呼吸驱动显著低于正常对照组，与文献报道及我们以前的研究结果一致[1，4]。家系研究的结果表明Ⅱ型呼吸衰竭患者的子女中，部分子女低氧呼吸驱动降低，且这部分子女并不存在气道阻塞、呼吸肌衰竭及神经肌肉疾患，亦无高原生活史，不存在低氧适应所致的低氧反应性下降，因此其低氧反应性下降的原因可能主要受遗传因素的影响，与文献所述COPD患者低氧反应性下降具有家族聚集性，显示出其遗传效应的结论相一致，并除外了α1-AT缺陷的可能[5-7]。患者组的ΔP0.1/ΔSaO2显著低于低氧反应正常子女组，而与低氧反应降低组子女组无显著差异。虽然患者组、子女组ΔVE/ΔSaO2与对照组无显著差异，但ΔP0.1/ΔSaO2降低子女的ΔVE/ΔSaO2显著低于ΔP0.1/ΔSaO2正常组，而这两组子女的动脉血气、肺功能均正常，具有可比性。P0.1仅反应吸气驱动水平，而VE则同时受吸气和呼气过程的影响以及不同研究对象气道阻力等机械因素的影响，因此，二者对低氧的反应性并不一定十分相关。COPD患者的部分健康子女低氧反应性下降提示遗传因素在低通气发生中可能起着一定作用。
, 百拇医药
图1 D6S1629位点(a)、D6S276位点(b)和D6S1791位点(c)的基因型多态性分布 E为D6S1629的代号；C为D6S276的代号；D为D6S1701的代号；序数表示扩增的等位基因片段从大到小的顺序 图2家系2 D6S1701位点的基因型 Ⅰ代表第1代；Ⅱ1～Ⅱ5代表Ⅰ1的5个子女
Fig 1 Genotypes of D6S1629(a), D6S276(b),and D6S1701(c) E：the symbol of D6S1629；C：the symbol of D6S276；D：the symbol of D6S1701； ordinal number from large to small is in accordance to the length of PCR products Fig 2 Genotype of D6S1701 in family 2 Ⅰ represents the first generation, Ⅱ1-Ⅱ5 represent the five offsprings of Ⅰ1
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表4 各位点等位基因及杂合率
Table 4 Observed allele number and heterozygosity of microsatellites
Characteristics of alleles
(等位基因性状)
Loci of microsatellites(微卫星位点)
D6S299
D6S1691
D6S276
D6S1701
D6S1629
, 百拇医药
Observed allele number(等位基因数)
8
12
9
8
6
Heterozygosity(%)(杂合率)
74.5
80.8
78.9
70.2
60
, 百拇医药
表5 连锁分析的重组率及Lods值
Table 5 Recombination rate and Lod score
Loci of
microsatellites
(微卫星位点)
Recombination rates(重组率)(θ)
Max(θ)
(最大Lod值)
0.00
0.01
0.05
, 百拇医药
0.10
0.20
0.30
0.40
D6S299
-∞
-4.73
-2.09
-1.09
-0.32
-0.01
-0.00
0.00(0.40)
, 百拇医药
D6S1691
-∞
-5.54
-2.28
-1.07
-0.20
0.03
0.03
0.03(0.30)
D6S276
-∞
0.44
1.53
, 百拇医药
1.74
1.49
0.92
0.31
1.74(0.10)
D6S1701
-∞
-0.81
-0.19
0.02
0.12
0.09
0.03
, 百拇医药
0.12(0.20)
D6S1629
-∞
-6.42
-3.07
-1.75
-0.65
-0.21
0.03
0.03(0.40)
尽管肺功能受损、气流阻力增高在COPD发生Ⅱ型呼吸衰竭的过程中起着重要作用，但肺功能与通气量之间并无明确的相关性，临床上观察到具有相同气道阻塞程度的COPD患者，有的出现二氧化碳潴留，有的不出现。因此，COPD发生Ⅱ型呼吸衰竭的原因除了COPD本身的病理因素之外，其呼吸中枢反应性的异常也是造成低氧、二氧化碳潴留的原因。我们的研究表明，COPD患者低氧呼吸驱动降低可能是其发生呼吸衰竭的原因之一，而且这一缺陷可以遗传给子代，使之对低氧的反应性也降低。
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3.2 连锁分析结果 家系分析表明，低氧呼吸驱动反应性降低呈显性症状，且在连续两代出现，患者为杂合子，亲代一方低氧反应性降低，子女低氧反应性降低的概率近1/2，男女患病机会均等，符合外显完全的常染色体显性遗传方式。
我们曾于1993～1996年间对COPDⅠ型呼吸衰竭和Ⅱ型呼吸衰竭患者的家系进行低氧和高二氧化碳呼吸驱动的研究[1]，证明Ⅱ型呼吸衰竭患者的子女部分低氧反应性降低，并与D6S276呈连锁关系。此次我们以D6S276为中心，选择了附近5个微卫星标志进行分析，结果证实了在部分子女中确实存在低氧呼吸驱动降低，支持低氧呼吸驱动的遗传性。各个微卫星位点在大约100名北京地区中国人、200条染色体上的分布具有较高的多态性。家系中大多数个体多态性的位点为杂合，能够提供信息。通过核心家系连锁分析，与致病基因间连锁的最大Lod值为D6S276：1.74(θ=0.10)，支持致低氧反应性降低的基因与D6S276紧密连锁，与我们原先的结论一致[1]。原家系分析与D6S276连锁的Lod值=2.924，θ=0，造成连锁分析的Lod值反而降低的原因可能在于：(1)实验方法不同：我们原先采用的虽然也是Amp-FLP方法，但电泳是用小型垂直电泳槽进行的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，而且未进行各微卫星位点的多态性分析，仅对家系成员的标本进行分析。由于电泳分辨率不够高，5个家系中最终用于连锁分析的有效家系仅3家。实验方法的不同可能在识读基因型时产生系统误差，影响最后统计结果。(2)统计方法不同：两次实验结果虽然都采用的是Lods法，但由于前次实验无各位点多态性资料，也无法判断家系成员标本的具体基因型，故只有依靠查表法计算Lod值。查表法忽略了基因频率、外显率、发病率等因素，往往使Lod值较实际情况有所升高，目前已多不采用。
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COPD属于晚发病，发病年龄一般在40岁以后，待发生Ⅱ型呼吸衰竭年龄就更迟一些，此时患者的父母可能已经去世，而子代尚未发病，同时呼吸驱动在老年人(第1代)和少儿组(第3代)的测定结果还存在差异，因此，同时有3代以上成员的家系资料很难收集。也正是由于这一原因，使COPD的遗传学研究进展缓慢。目前，许多学者认为当前对于COPD有待研究的重要课题主要是鉴别与COPD有关的生化、遗传和分子标志物，特别应强调的是需查明与易感性有关的遗传学因子和其它宿主因子[8]。我们仅从呼吸驱动的角度探讨了COPD发生Ⅱ型呼吸衰竭的遗传学因素，对于COPD这一广泛领域来说，还有许多方面有待于进一步研究和探索。
基金项目：国家自然科学基金(39770337)
通信作者：季蓉(E-mail:jir@hotmail.com)
作者单位：季蓉(100044 北京医科大学人民医院呼吸科)
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何权瀛(100044 北京医科大学人民医院呼吸科)
张荣葆(100044 北京医科大学人民医院呼吸科)
高占成(100044 北京医科大学人民医院呼吸科)
丁东杰(100044 北京医科大学人民医院呼吸科)
参考文献
[1]Zhang RB, Ding DJ, Cheng ErZH, et al. A study on the genetic factor in the development of carbon dioxide retention in chronic obstructive pulmonary disease patients with respiratory failure. Chin J Intern Med, 1998, 37∶749-752.[张荣葆，丁东杰，陈尔璋，等.对慢性阻塞性肺病呼吸衰竭患者二氧化碳潴留机制的探讨.中华内科杂志，1998，37∶749-752].
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[2]Rebuck AS, Campbell EJM. A clinical method for assessing the ventilatory response to hypoxia. Am Rev Respir Dis, 1974, 109∶345-350.
[3]Bassam BJ, Caetamo-Anollis G, Gresshoff PM. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem, 1991, 196∶80-83.
[4]Kepron W, Chemiack RM. The ventilatory response to hypercapnia and to hypoxemia in chronic obstructive lung disease. Am Rev Respir Dis, 1973, 108∶843.
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[5]Moore GC, Zwillich CW, Battaglia JD, et al. Respiratory failure associated with familial depression of ventilatory response to hypoxia and hypercapnia. N Engl J Med, 1978, 295∶861-865.
[6]Mountain R, Zwillich C, Weil J. Hypoventilation in obstructive lung disease. N Engl J Med, 1978, 298∶521-525.
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[8]Petty TL, Weinmann GG. Building a national strategy for the prevention and management of and research in chronic obstructive pulmonary disease. National Heart, Lung, and Blood Institute workshop summary. JAMA, 1997, 277∶246-253., http://www.100md.com