周围血管疾病基因治疗的研究进展(2)
继EC和SMC后，单核巨噬细胞(M()可能是兼具靶细胞和载体细胞双重功能的细胞，在ASO和再狭窄的基因治疗中发挥重要作用[14]。
2 载体系统的改良
载体的选择决定了外源基因能否在体内高效、稳定的表达。能将目的基因导入靶血管的载体主要有病毒载体和非病毒载体，可以单独使用或联合应用。
2.1 病毒载体 目前常用的有腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、腺相关病毒、日本凝血病毒等。每种病毒载体各有优点，但也有许多的目前尚无法完全克服的缺点，从而影响了它们在基因治疗中的应用效果。
2.1.1 腺病毒载体 是直径70～100nm的稳定颗粒，可以制成高滴度的液体，有较大的宿主范围(可达7.5kb)，可以感染非分裂期细胞，而且感染细胞时外源基因不整合到宿主染色体，潜在的致癌危险小，因此被视为血管疾病基因转移和基因治疗的理想载体。腺病毒载体用于转染SMC具有高效、迅速和稳定的特点，介导基因导入SMC的效率是脂质体载体的250倍[15]。目前应用的腺病毒血清型主要有2型和5型两种。腺病毒载体存在的主要问题是免疫反应，包括细胞免疫和体液免疫两方面，其特点是单核细胞浸润进入血管壁，破坏腺病毒转染的靶细胞，清除外源基因，并且产生腺病毒抗体使第二次应用该载体失效。Schulick等报道57%的成年人血清中存在5型腺病毒抗体[16]。为减少腺病毒的免疫原性，目前采取的策略有：①在用外源基因取代腺病毒E1区构建的第一代复制缺陷型腺病毒载体的基础上，进一步删除E4区、诱导E2区定点突变、增加E3区基因表达，构建成第三代复制缺陷型腺病毒载体[17]；②紫外线照射腺病毒载体可减少病毒基因的表达，却不影响腺病毒携带外源基因、与腺病毒受体结合进入靶细胞的功能，其效果类似第三代腺病毒载体[18]；③借用肿瘤基因治疗中的一种新策略，用腺病毒载体携带一种具有免疫调节作用的细胞毒基因FasL导入血管壁后，既能与SMC表面的细胞凋亡分子Fas结合，诱导SMC凋亡，减轻内膜增生，又能抑制单核淋巴细胞向血管壁的浸润，从而有效地避免宿主对腺病毒的免疫杀伤，为腺病毒载体在ASO和血管再狭窄的基因治疗中提供新的应用策略[2]。
, 百拇医药
2.1.2 逆转录病毒载体 能将外源基因稳定地插入处于分裂期的靶细胞染色体中，感染效率较高，由于有潜在的致癌危险，且大多数血管壁细胞处于静止状态，故逆转录病毒较少应用于血管疾病的转基因治疗。
2.1.3 痘苗病毒 具有与腺病毒类似的容量大、可感染静止期细胞、基因不整合入宿主染色体等优点，但存在表达时间有限、稳定性差的缺点。
2.1.4 腺相关病毒 能将外源基因定点整合至宿主细胞，比逆转录病毒具有更优越的特性。
2.1.5 日本凝血病毒(HVJ) 经灭活后能与脂质体载体结合成为复合型载体，可提高外源基因的转染效率。Bai等报道用HVJ-脂质体复合载体在体外转染用于旁路转流术的自体静脉后，能提高转流术后自体移植静脉的转基因表达[19]。
病毒类载体的靶向性和组织特异性差、可控性小是共同的缺点，是急需解决的难点，成为研究的热点。例如为解决病毒载体的靶向性问题，可将靶细胞表面特异性抗体和病毒外壳蛋白的抗体偶联成复合抗体，再将病毒载体与靶细胞的特异受体相连，从而达到靶向基因转染的目的。采用双特异的分子桥可能解决病毒载体感染细胞的特异性问题。应用组织特异性的细胞启动子可能是有效调控治疗基因表达水平的重要方法。但这些方法目前仅处于实验研究阶段，离临床应用尚有距离。, 百拇医药(赵意平 张柏根)
2 载体系统的改良
载体的选择决定了外源基因能否在体内高效、稳定的表达。能将目的基因导入靶血管的载体主要有病毒载体和非病毒载体，可以单独使用或联合应用。
2.1 病毒载体 目前常用的有腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、腺相关病毒、日本凝血病毒等。每种病毒载体各有优点，但也有许多的目前尚无法完全克服的缺点，从而影响了它们在基因治疗中的应用效果。
2.1.1 腺病毒载体 是直径70～100nm的稳定颗粒，可以制成高滴度的液体，有较大的宿主范围(可达7.5kb)，可以感染非分裂期细胞，而且感染细胞时外源基因不整合到宿主染色体，潜在的致癌危险小，因此被视为血管疾病基因转移和基因治疗的理想载体。腺病毒载体用于转染SMC具有高效、迅速和稳定的特点，介导基因导入SMC的效率是脂质体载体的250倍[15]。目前应用的腺病毒血清型主要有2型和5型两种。腺病毒载体存在的主要问题是免疫反应，包括细胞免疫和体液免疫两方面，其特点是单核细胞浸润进入血管壁，破坏腺病毒转染的靶细胞，清除外源基因，并且产生腺病毒抗体使第二次应用该载体失效。Schulick等报道57%的成年人血清中存在5型腺病毒抗体[16]。为减少腺病毒的免疫原性，目前采取的策略有：①在用外源基因取代腺病毒E1区构建的第一代复制缺陷型腺病毒载体的基础上，进一步删除E4区、诱导E2区定点突变、增加E3区基因表达，构建成第三代复制缺陷型腺病毒载体[17]；②紫外线照射腺病毒载体可减少病毒基因的表达，却不影响腺病毒携带外源基因、与腺病毒受体结合进入靶细胞的功能，其效果类似第三代腺病毒载体[18]；③借用肿瘤基因治疗中的一种新策略，用腺病毒载体携带一种具有免疫调节作用的细胞毒基因FasL导入血管壁后，既能与SMC表面的细胞凋亡分子Fas结合，诱导SMC凋亡，减轻内膜增生，又能抑制单核淋巴细胞向血管壁的浸润，从而有效地避免宿主对腺病毒的免疫杀伤，为腺病毒载体在ASO和血管再狭窄的基因治疗中提供新的应用策略[2]。
, 百拇医药
2.1.2 逆转录病毒载体 能将外源基因稳定地插入处于分裂期的靶细胞染色体中，感染效率较高，由于有潜在的致癌危险，且大多数血管壁细胞处于静止状态，故逆转录病毒较少应用于血管疾病的转基因治疗。
2.1.3 痘苗病毒 具有与腺病毒类似的容量大、可感染静止期细胞、基因不整合入宿主染色体等优点，但存在表达时间有限、稳定性差的缺点。
2.1.4 腺相关病毒 能将外源基因定点整合至宿主细胞，比逆转录病毒具有更优越的特性。
2.1.5 日本凝血病毒(HVJ) 经灭活后能与脂质体载体结合成为复合型载体，可提高外源基因的转染效率。Bai等报道用HVJ-脂质体复合载体在体外转染用于旁路转流术的自体静脉后，能提高转流术后自体移植静脉的转基因表达[19]。
病毒类载体的靶向性和组织特异性差、可控性小是共同的缺点，是急需解决的难点，成为研究的热点。例如为解决病毒载体的靶向性问题，可将靶细胞表面特异性抗体和病毒外壳蛋白的抗体偶联成复合抗体，再将病毒载体与靶细胞的特异受体相连，从而达到靶向基因转染的目的。采用双特异的分子桥可能解决病毒载体感染细胞的特异性问题。应用组织特异性的细胞启动子可能是有效调控治疗基因表达水平的重要方法。但这些方法目前仅处于实验研究阶段，离临床应用尚有距离。, 百拇医药(赵意平 张柏根)