条斑紫菜单细胞固体培养的初步研究.PDF
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2006年2月23日
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参见附件(196KB，6页)。
条斑紫菜单细胞固体培养的初步研究
贺丽虹1
，沈颂东2
，黄鹤忠1
农业科技学院， 生命科学学院，苏州大学，江苏 苏州 (1. 2. 215006 )
摘要 ：成熟条斑紫菜叶状体酶解后获得单细胞，分别培养于添加了不同浓度 营养盐的和 N, P 0.5 % 1.
的琼胶培养基上，观察细胞的分化发育情况。结果显示： 营养细胞大部分先发育为细胞团，细胞 0 % ( 1 )
团放散孢子，再由孢子萌发形成小苗。其余营养细胞极性分裂形成正常细胞苗或带假根的形状不规则的片
状体。孢子苗和营养细胞直接形成的幼苗生长到一定大小均可放散单孢子，单孢子能够正常萌发形成单孢
子苗。 在 的琼胶培养基上或较高浓度的营养盐中，细胞发育快。添加 ( 2 ) 0.5 % 5 mgL NO3 和 -N 0.5 mg
L H2PO4 营养盐不能满足细胞生长发育的需要，培育 绝大部分仍为单细胞，不能形成正常幼苗。 -P 20 d
关键词：条斑紫菜； 固体培养；琼胶浓度；氮；磷
中图分类号：； Q943.1 S968.43
+
1 文献标识码：A 文章编号：1001-6392(2004)05-0040-06
引言
紫菜栽培已成为我国海藻栽培业的支柱产业，而条斑紫菜更是主要的栽培品种和出口创
汇产品。围绕紫菜遗传育种和细胞工程育苗已作了许多卓有成效的工作，特别在紫菜叶状体
细胞成苗方面，早期采用微生物发酵法、研磨法获得原生质体并培养成株[1-3]
，随后用海螺
酶酶解紫菜细胞成功并再生成苗[4]。方宗熙、戴继勋、王素娟等还用酶解得到的营养细胞进
行了育苗试验[5-7]。利用酶解的紫菜叶状体细胞进行育苗已完成了小型生产试验，并形成了
一套操作工艺[8]。关于条斑紫菜和坛紫菜营养细胞和原生质体的液体培养已有较多的研究报
道[1-12]
，相比之下有关固体培养的研究报道较少[13-15]。与液体培养相比，固体培养能够实现
对单细胞的定点观察，因此在细胞变异体筛选和其他遗传育种研究中具有许多优点。本文就
条斑紫菜细胞在固体培养中的分化发育情况及培养基浓度、添加的氮、磷营养盐浓度对细胞
发育的影响进行了初步研究。
材料与方法 1
材料 1.1
实验所用条斑紫菜 年 月采自江苏省如东县养殖网帘。干燥到一定程度后保存于 2002 3
冰柜中。实验前 取出，在消毒海水中复苏。复苏采用室温 ℃ ，自然光条件。酶解前 3 d (15 )
挑选健康完整的叶片，用毛笔在消毒海水中反复洗刷 遍，然后在 溶液中浸泡 2 0.7 % KI 10
，再用消毒海水漂洗 遍，放入青霉素小瓶中，剪碎，备用。 min 2
培养基制备 1.2
琼胶培养基以添加了 营养盐的消毒海水配制，设 和 两个浓度梯度， N, P 0.5 % 1.0 %
第 卷第期 23 5 海洋通报 ， Vol. 23 No.5
年月 2004 10 MARINE SCIENCE BULLETIN Oct. 2004
收稿日期： ；收修改稿日期： 20030624 20030908
基金项目：国家自然科学基金青年基金项目(编号 )资助 40206019
期 贺丽虹等：条斑紫菜单细胞固体培养的初步研究 5 41
在 ℃ 高压灭菌 。 营养盐按 ∶ 的 ∶ 比，设 120 30 min N, P 10 1 N P 5 mgL NO3-N, 0.5 mgL
H2PO4 ； -P 50 mgL NO3-N, 5 mgL H2PO4 ； -P 100 mgL NO3-N, 10 mgL H2PO4 共 个浓度梯 -P 3
度。每个处理设 个重复。 1
单细胞制备 1.3
实验室自制粗海螺酶经 μ 滤膜过滤后，加入一定量葡萄糖即为酶解液。酶解在 0.22 m
室温 ℃ 下进行。 后以 目尼龙筛绢过滤，除去碎藻块，细胞悬液在 (15 ) 4 h 300 3000 r min
离心 ，除去上层酶液。所得细胞以消毒海水稀释后接种。 5 min
培养方法 1.4
细胞接种后以涂布棒涂布均匀，培养皿以 膜封口。在 ℃，～ Parafilm 20 photon 30 50
μ· mol cm-2
·s
-1
， ∶ 的恒温培养箱中培养。整个培养过程中不再更换培养基。 12 L 12 D
结果 2
在固体培养基上细胞的分化发育情况 2.1
成熟条斑紫菜叶状体酶解后所得的细胞有营养细胞、果孢子和未发育成熟的果孢子囊器
和精子囊器。在固体培养基上它们都可继续完成其分化、发育途径。
营养细胞的发育情况 营养细胞主要沿着 条途径继续发育。① 形成细胞团。形 2.1.1 2
成细胞团的营养细胞的第一次分裂没有极性分化，为二等分裂，形成的 个细胞可再行等分 2
裂直至形成多细胞团。细胞团内的细胞数目从数个至数十个不等，共用一个细胞壁。培育
～ 左右，多细胞团壁破裂，放散孢子。孢子散布于细胞团空壳周围，少数仍留在壳 10 14 d
内。这些由细胞团放散的孢子均可萌发为正常幼苗 图 。② 直接萌发为正常幼苗和不规 ( 1-A)
则片状体。一般在接种后 ～ ，部分营养细胞一端延伸出透明的萌发管，随后极性分裂， 3 4 d
产生 个细胞。一个细胞色素少，具有透明的萌发管，萌发管不断伸长分化为假根；另一个 2
细胞原生质体浓厚，经多次分裂形成幼苗的叶状体。所产生的叶状体有 种情况，一种是细 2
胞先进行多次横分裂形成～ 多个细胞的细长单列细胞苗，然后再进行纵分裂形成多列 15 30
细胞的细胞苗，为与后者相区别，我们称之为正常细胞苗 图 ；另一种是细胞分裂形成 ( 1-B)
个细胞左右的单列细胞苗后即开始纵分裂 图 ，形成宽短的单层细胞的片状体 图。 10 ( 2) ( 3)
一般前者 正常细胞苗 能够迅速生长形成大苗，细胞小，排列紧密，单孢子放散较迟 ( )
图 ；后者(宽短的单层细胞片状体)细胞较大，在形成～ 列细胞后即从叶片顶端开 ( 4 ) 5 8
始解体，放散单孢子，其叶片的大部分甚至全部都能形成单孢子 图。 ( 3)
极少数细胞极性分裂后形成带假根的多层细胞体 图 ，后解体，放散孢子，孢子可正 ( 5)
常萌发成苗。
总之，在固体培养基上幼苗主要有 个来源：① 营养细胞直接成苗。这种苗发育早， 3
个体大。② 细胞团放散孢子成苗。③ 叶片放散单孢子成苗。后二种苗发育迟，个体相对较
小。
果孢子和果孢子囊的发育 成熟条斑紫菜叶状体上有发育程度不同的果孢子囊。 2.1.2
发育成熟的果孢子囊酶解后得到果孢子 ......
贺丽虹1
，沈颂东2
，黄鹤忠1
农业科技学院， 生命科学学院，苏州大学，江苏 苏州 (1. 2. 215006 )
摘要 ：成熟条斑紫菜叶状体酶解后获得单细胞，分别培养于添加了不同浓度 营养盐的和 N, P 0.5 % 1.
的琼胶培养基上，观察细胞的分化发育情况。结果显示： 营养细胞大部分先发育为细胞团，细胞 0 % ( 1 )
团放散孢子，再由孢子萌发形成小苗。其余营养细胞极性分裂形成正常细胞苗或带假根的形状不规则的片
状体。孢子苗和营养细胞直接形成的幼苗生长到一定大小均可放散单孢子，单孢子能够正常萌发形成单孢
子苗。 在 的琼胶培养基上或较高浓度的营养盐中，细胞发育快。添加 ( 2 ) 0.5 % 5 mgL NO3 和 -N 0.5 mg
L H2PO4 营养盐不能满足细胞生长发育的需要，培育 绝大部分仍为单细胞，不能形成正常幼苗。 -P 20 d
关键词：条斑紫菜； 固体培养；琼胶浓度；氮；磷
中图分类号：； Q943.1 S968.43
+
1 文献标识码：A 文章编号：1001-6392(2004)05-0040-06
引言
紫菜栽培已成为我国海藻栽培业的支柱产业，而条斑紫菜更是主要的栽培品种和出口创
汇产品。围绕紫菜遗传育种和细胞工程育苗已作了许多卓有成效的工作，特别在紫菜叶状体
细胞成苗方面，早期采用微生物发酵法、研磨法获得原生质体并培养成株[1-3]
，随后用海螺
酶酶解紫菜细胞成功并再生成苗[4]。方宗熙、戴继勋、王素娟等还用酶解得到的营养细胞进
行了育苗试验[5-7]。利用酶解的紫菜叶状体细胞进行育苗已完成了小型生产试验，并形成了
一套操作工艺[8]。关于条斑紫菜和坛紫菜营养细胞和原生质体的液体培养已有较多的研究报
道[1-12]
，相比之下有关固体培养的研究报道较少[13-15]。与液体培养相比，固体培养能够实现
对单细胞的定点观察，因此在细胞变异体筛选和其他遗传育种研究中具有许多优点。本文就
条斑紫菜细胞在固体培养中的分化发育情况及培养基浓度、添加的氮、磷营养盐浓度对细胞
发育的影响进行了初步研究。
材料与方法 1
材料 1.1
实验所用条斑紫菜 年 月采自江苏省如东县养殖网帘。干燥到一定程度后保存于 2002 3
冰柜中。实验前 取出，在消毒海水中复苏。复苏采用室温 ℃ ，自然光条件。酶解前 3 d (15 )
挑选健康完整的叶片，用毛笔在消毒海水中反复洗刷 遍，然后在 溶液中浸泡 2 0.7 % KI 10
，再用消毒海水漂洗 遍，放入青霉素小瓶中，剪碎，备用。 min 2
培养基制备 1.2
琼胶培养基以添加了 营养盐的消毒海水配制，设 和 两个浓度梯度， N, P 0.5 % 1.0 %
第 卷第期 23 5 海洋通报 ， Vol. 23 No.5
年月 2004 10 MARINE SCIENCE BULLETIN Oct. 2004
收稿日期： ；收修改稿日期： 20030624 20030908
基金项目：国家自然科学基金青年基金项目(编号 )资助 40206019
期 贺丽虹等：条斑紫菜单细胞固体培养的初步研究 5 41
在 ℃ 高压灭菌 。 营养盐按 ∶ 的 ∶ 比，设 120 30 min N, P 10 1 N P 5 mgL NO3-N, 0.5 mgL
H2PO4 ； -P 50 mgL NO3-N, 5 mgL H2PO4 ； -P 100 mgL NO3-N, 10 mgL H2PO4 共 个浓度梯 -P 3
度。每个处理设 个重复。 1
单细胞制备 1.3
实验室自制粗海螺酶经 μ 滤膜过滤后，加入一定量葡萄糖即为酶解液。酶解在 0.22 m
室温 ℃ 下进行。 后以 目尼龙筛绢过滤，除去碎藻块，细胞悬液在 (15 ) 4 h 300 3000 r min
离心 ，除去上层酶液。所得细胞以消毒海水稀释后接种。 5 min
培养方法 1.4
细胞接种后以涂布棒涂布均匀，培养皿以 膜封口。在 ℃，～ Parafilm 20 photon 30 50
μ· mol cm-2
·s
-1
， ∶ 的恒温培养箱中培养。整个培养过程中不再更换培养基。 12 L 12 D
结果 2
在固体培养基上细胞的分化发育情况 2.1
成熟条斑紫菜叶状体酶解后所得的细胞有营养细胞、果孢子和未发育成熟的果孢子囊器
和精子囊器。在固体培养基上它们都可继续完成其分化、发育途径。
营养细胞的发育情况 营养细胞主要沿着 条途径继续发育。① 形成细胞团。形 2.1.1 2
成细胞团的营养细胞的第一次分裂没有极性分化，为二等分裂，形成的 个细胞可再行等分 2
裂直至形成多细胞团。细胞团内的细胞数目从数个至数十个不等，共用一个细胞壁。培育
～ 左右，多细胞团壁破裂，放散孢子。孢子散布于细胞团空壳周围，少数仍留在壳 10 14 d
内。这些由细胞团放散的孢子均可萌发为正常幼苗 图 。② 直接萌发为正常幼苗和不规 ( 1-A)
则片状体。一般在接种后 ～ ，部分营养细胞一端延伸出透明的萌发管，随后极性分裂， 3 4 d
产生 个细胞。一个细胞色素少，具有透明的萌发管，萌发管不断伸长分化为假根；另一个 2
细胞原生质体浓厚，经多次分裂形成幼苗的叶状体。所产生的叶状体有 种情况，一种是细 2
胞先进行多次横分裂形成～ 多个细胞的细长单列细胞苗，然后再进行纵分裂形成多列 15 30
细胞的细胞苗，为与后者相区别，我们称之为正常细胞苗 图 ；另一种是细胞分裂形成 ( 1-B)
个细胞左右的单列细胞苗后即开始纵分裂 图 ，形成宽短的单层细胞的片状体 图。 10 ( 2) ( 3)
一般前者 正常细胞苗 能够迅速生长形成大苗，细胞小，排列紧密，单孢子放散较迟 ( )
图 ；后者(宽短的单层细胞片状体)细胞较大，在形成～ 列细胞后即从叶片顶端开 ( 4 ) 5 8
始解体，放散单孢子，其叶片的大部分甚至全部都能形成单孢子 图。 ( 3)
极少数细胞极性分裂后形成带假根的多层细胞体 图 ，后解体，放散孢子，孢子可正 ( 5)
常萌发成苗。
总之，在固体培养基上幼苗主要有 个来源：① 营养细胞直接成苗。这种苗发育早， 3
个体大。② 细胞团放散孢子成苗。③ 叶片放散单孢子成苗。后二种苗发育迟，个体相对较
小。
果孢子和果孢子囊的发育 成熟条斑紫菜叶状体上有发育程度不同的果孢子囊。 2.1.2
发育成熟的果孢子囊酶解后得到果孢子 ......
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