顺磁共振和傅里叶变换红外光谱法研究高温对荒漠苔藓质膜结构影响
摘要 运用顺磁共振波谱和原位傅立叶变换显微红外光谱研究了高温对荒漠植物刺叶墙藓不同叶龄水合组织质膜透性和膜蛋白二级结构的影响。自旋标记法研究质膜透性结果表明，处理前野生叶质膜透性普遍高于室内培养获得的原丝体和次生叶，处理后次生叶膜透性变化最大，比处理前增加4倍，其次为原丝体。质膜透性随叶龄增加，变化幅度逐渐降低。红外光谱的二阶求导、傅立叶自解卷积及拟合分峰等结果显示，各叶龄间蛋白质二级结构含量差异较大，表明各龄组织蛋白成分不完全相同；高温处理后次生叶和原丝体α螺旋含量分别比对照增加40%和16%；其它叶龄组织二级结构含量变化范围小，表明热胁迫下老龄组织蛋白质二级结构稳定。膜透性和膜蛋白二级结构分析证明，膜透性和蛋白质稳定性呈正相关，指示蛋白质组成和含量不同是造成各龄组织不同耐热性的主要原因之一。
关键词 质膜结构，耐热性，自旋标记，原位红外，刺叶墙藓
1 引言
研究荒漠苔藓植物对逆境胁迫适应性，不仅有助于人工培育生物结皮保护生态环境，还可以利用苔藓植物抗逆基因改良农作物。随着全球环境变化，我国西北地区气候正面临从干热到湿热型转变，而且年平均温度以0.2℃增加[1]。沙漠土壤表层间歇性高温对荒漠苔藓在沙漠地区分布产生选择压力，特别是水合生长繁殖期间。水合组织在热胁迫超过40℃,组织遭受破坏，短时间(30 min以内)暴露于42～51℃下将造成大部分苔藓死亡，主要由于高温造成细胞膜结构破坏，溶质渗漏导致细胞死亡[2]。而墙藓类能够在期间存活[3]，热处理后不同叶龄叶片繁殖能力存在显著差异，其减少损伤和自我保护机理尚不完全清楚。利用生物化学方法研究苔藓质膜热胁迫响应存在诸多缺陷[4～6]，而电子顺磁共振波谱 (EPR)自旋标记和傅立叶变换显微红外光谱 (FTIR microscope)在研究逆境对生物膜组成和结构方面，比传统生理生化方法具有更简单前处理和更高精确度[7,8]。FTIR方法广泛应用于医学 [9～11]，用于植物组织膜结构对环境胁迫响应是近几年国内外研究热点[12～15]；EPR研究集中在干燥对种子和花粉质膜透性的影响[12,13]，应用于营养体高温胁迫研究尚未见报道。本研究选择古尔班通古特沙漠分布相对广泛的耐干性苔藓刺叶墙藓(Tortula desertorum)作为研究材料，利用EPR和原位红外探讨了短时高温对荒漠苔藓叶片和原丝体水合组织膜结构的影响。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂及材料BrukerEMX8 EPR(Bruker BioSpin Corp.， Germany)、BIORAD FT185 FTIR Microscope (内装液氮冷却的窄带MCT检测器,美国Varan Corp.公司)、真空干燥箱、真空抽滤机、培养箱(江南仪器厂)。TEMPONE (4氧2，2，6，6四甲基吡啶)、K3[Fe(CN)3]、D2O(Sigmaaldrich Corp.，USA)。供试材料为刺叶墙藓(T.desertorum)，经上海师范大学曹同教授鉴定，采集自新疆古尔班通古特沙漠相邻土壤结皮。
2.2 实验方法
2.2.1 不同组织获得及生物热胁迫 野外采集刺叶墙藓雌配子体经过48 h直接水合后，按照Stark [3]叶龄划分标准， 将刺叶墙藓叶片分为幼叶(1年生)、绿叶(4年生)、黄绿叶(6年生)、黄叶(10年生)。叶片用Knop固体培养基(1.0 g/L Ca(NO3)2·4H2O、 0.25 g/L KH2PO4、 0.12 g/L KCl、 0.25 g/L MgSO4·7H2O 以及微量FeCl3·6H2O)室内培养。 培养条件设置为：湿度90%，光照时间为14 h/d，昼夜温度为20℃/10℃，光照强度为85～120 PPFD。不同叶龄水合组织45℃水浴加热1 h后备用。
2.2.2 自旋标记EPR测定 分别配置100 mL 的1 mmol TEMPONE、120 mmol K3[Fe(CN)6]溶液，保存于0～4℃冰箱。材料浸入TEMPONE溶液，轻微摇动后静置20 min，然后加入K3[Fe(CN)6]溶液，静置10 min，抽滤至表面无水后载入2 mm毛细管，放入EPR采样器测定。为增加信噪比，固定测量参数采集3次取平均值。
2.2.3 原位显微红外测定 材料在通风橱自然干燥48 h，样品相对含水量(WC)控制在0.1 g/g DW(DW为干重)以内。干燥组织用金属片压薄，厚度10~15 μm，尽量保证叶片完整。为了检验干燥处理对材料的影响，新鲜叶片用D2O浸泡2 h，旋转蒸发去表面D2O后直接采谱。以银为反射参比，分辨率4 cm-1，150次扫描累加。所得光谱是采集谱和现时采集的水汽以及CO2谱的差谱。所有光谱采集面积固定为150 μm×150 μm，每个样品采集3个点，重复两个样品，结果只显示其中一条代表性光谱。采用BioRad自带软件对红外光谱进行傅立叶自解卷积和二阶导数处理，进行拟合分峰，计算峰面积，面积取6次测量平均值以减少误差。
3 结果与讨论
3.1 热胁迫对膜透性的影响刺叶墙藓EPR测定谱图是极性区细胞质和疏水区TEMPONE分子两个信号的叠加(图1)。K3[Fe(CN)6] 能够屏蔽膜外TEMPONE信号，但不能够穿透完整细胞膜，所以非极性区以内TEMPONE分子信号没有被屏蔽。如果细胞膜有一定程度破损，K3[Fe(CN)6]将穿透细胞膜进入极性区，屏蔽细胞质内TEMPONE信号。K3[Fe(CN)6] 不能进入非极性脂质层内部，所以TEMPONE脂质峰(lipid peak， L)值可以作为内标。脂质峰与细胞质峰(water peak， W)线高比值由穿透细胞膜进入细胞质的K3[Fe(CN)6]量决定，可用来评价质膜透性，方程为：P＝L/W(1) 其中P为质膜渗透性强度，L为脂质峰高，W为 细胞质峰高。L/W值越高，表明细胞质膜透性越强，可以用来评价生物与环境胁迫之间损伤和自我保护关系[12]。比较其它不同生长时间的叶片L/W值(图2A)发现，处理前组织L/W值随组织生长时间缓慢增加，数值在0.10以内；处理后L/W值都在0.15以上，能够明显区别各叶龄细胞膜透性强度，证明利用L/W值作为质膜透性强度比传统的电导率法精确，能够区分微小差异。以处理前后L/W值作比作为衡量热胁迫膜损伤强度(图2B)，发现质膜损伤强度同生长时间显著负相关(r=0.88)，方程为:Y=5.13-0.28X(2) 其中X为生长时间。实验表明，在高温胁迫下刺叶苔藓幼嫩叶片质膜透性易受影响，这可能与其缺乏环境锻炼有关。
图1 刺叶墙藓次生叶热处理前后TEMPONE信号的 EPR谱(略)
Fig.1 Representative electron paramagnetic resonance (EPR) spectra of 4oxo2,2,6,6tetraethyl1piperidinyloxy (TEMPONE) in secondary leaves before and after thermostress
图2 荒漠苔藓不同叶龄组织热处理前后质膜透性(a)和质膜透性变化强度与叶龄相关关系(b)(略)
Fig.2 Plasma membrane permeability in different aging leaves of the desert moss T. desertorum before and after thermostress (a) and the relationship between ratio of permeability and leaf age (b)
P. 原丝体(protonema)； S. 次生叶(secondary leaf); J. 幼叶(juvenile leaf); G. 绿叶(green leaf); GY. 黄绿叶(greenyellow leaf); Y. 黄叶(yellow leaf)。
3.2 刺叶墙藓红外指纹图谱刺叶墙藓组织红外吸收光谱和二阶倒数谱(图3)表明，在3400 cm-1附近的吸收峰为OH和NH化学键伸缩振动谱带，表明组织内部含有大量的蛋白质和多糖类(图3A)。2928 cm-1附近为CH伸缩振动带，主要碳氢化合物存在引起。CH变角振动吸收位于1200～1500 cm-1之间，往往与其他吸收峰重叠。蛋白特征吸收区域存在于1658 cm-1(CO，酰胺Ⅰ带)、1560 cm-1(NH，酰胺Ⅱ带)和1260 cm-1(CN，酰胺Ⅲ带)。二阶导数处理后(图3B)明显可以观察到1728 cm-1处吸收峰，以及酰胺Ⅰ带存在5个吸收峰。
图3 刺叶墙藓次生叶红外吸收光谱(4000～1000 cm-1)(a)二阶导数谱图(b)(略)
Fig.3 Absorption spectra in the region of 4000 to 1000 cm-1 (a) and secondderivative spectra (b) of the desert moss T. desertorum secondary leaves
1，2分别代表热处理前后吸收谱，箭头标明显著变化(number of 1 and 2 represented spectra before and after thermostress respectively, an arrow indicated a significant change)。
热处理后幼叶在1728 cm-1附近为COOR特征吸收峰增强，主要表现为细胞壁胶质和细胞膜质结构内化合物变化。D2O取代水分测定结果显示，缓慢干燥对野生叶酯基吸收峰、酰胺 Ⅰ带影响甚小，可能与刺叶墙藓强耐干性有关，而对次生叶叶片脂基峰有影响，表明新生组织同野生在耐干性方面存在差异。
3.3 热胁迫对膜蛋白二级结构影响1700～1600 cm-1区域内的红外谱图为蛋白质酰胺Ⅰ带，运用傅立叶解卷积和拟合分峰将酰胺Ⅰ带分为1613、1631、1641、1659、1678和1690 cm-1等峰。对苔藓叶片膜蛋白二级结构进行指认[8,15]，确定1659 cm-1吸收峰为α螺旋，1631，1678 和1691 cm-1为α折叠和转角结构，1641 cm-1为无规则卷曲。刺叶墙藓不同叶龄间热处理前后蛋白质主要组成α螺旋和β折叠(含β转角)含量由49%～61%、34%～39%转变为54%～70%、24%～38%(见表1)，变化比较明显。热处理后每种水合组织不同程度上蛋白质二级结构都发生变化。原丝体和次生叶α螺旋含量热处理后分别增加40%和16%，相应β折叠含量相应减少；其他叶龄叶片 α螺旋和β折叠(含β转角)含量都有所增加，但变化范围不大，蛋白质二级结构相对稳定。蛋白质二级结构变化与膜透性结果比较发现，高温对组织膜透性的影响与膜蛋白二级结构变化情况呈正比(图2，表1)，说明蛋白质结构稳定有助于减少膜透性。同时组织间蛋白质二级结构各成分含量差异较大(表1)，证明不同叶龄组织蛋白质成分不同。老龄组织可能含有不同于新生组织的耐热性蛋白，使得其蛋白质结构比新生组织更加稳定。土生墙藓(tortula ruralis)在干燥胁迫时合成大量的LEA蛋白，水合时合成水合蛋白(hydrinlike proteins )，保护细胞在脱水或者水合膜结构[16,17]。同属的刺叶墙藓膜蛋白质二级结构热稳定是否与这类蛋白有关，有待进一步证明。
表1 刺叶墙藓不同叶龄组织45℃热处理前后蛋白质二级结构变化(略)
Table 1 Change of the secondary structure of different aging tissues of T. desertorum before and after treating at 45℃
4 结论
荒漠苔藓不同生长期水合组织对45℃热胁迫产生不同响应。EPR研究结果说明荒漠苔藓膜透性变化程度与叶龄呈显著负相关(r=0.88)。运用解卷积和分峰处理FTIR谱显示，不同叶龄组织膜蛋白二级结构α螺旋、β折叠等含量在叶龄间变化比较大，说明不同叶龄蛋白质成分不相同；原丝体、次生叶的蛋白质结构比其它叶龄对高温胁迫更为敏感。比较EPR和FTIR研究结果表明，膜透性强弱与蛋白质二级结构热稳定性有关，蛋白质结构越稳定，膜透性在热胁迫后变化越小。
致 谢 感谢中国科学院新疆生态与地理研究所张元明研究员和ElenaA.Golovina博士(Russian Academy of Sciences)给予的帮助。
References
1 Shi Yafeng(施雅风), Shen Yongping(沈永平). Science and Technology Review(科技导报), 2003, (2)： 54～57
2 Meyer H, Santarius K A. Oecologia, 1998, 11(5)： 1～8
3 Stark L R, McLetchie D N. Physiologia Plantarum, 2006, 126(2)： 187～195
4 Liu Y, Cao T, Glime J M. Bryologist, 2003, 106： 53～60
5 Liu Y, Li Z, Cao T, Glime J M. Journal of Bryology, 2004, 26： 265～271
6 Platt K A, Oliver M J, Thomson W W. Protoplasma, 1994, 178： 57～65
7 Wood A J, Duff R J, Oliver M J. Journal of Experimental Botany, 2001, 51(351)： 1655～1662
8 Yang J, Yen H E. Plant Physiol., 2002, 130(2)： 1032～1042
9 Sun Suqin(孙素琴), Liu Jun(刘 军), Zhou Qun(周 群). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2002, 30(2)： 140～143
10 Zhou Qun(周 群), Li Jing(李 静), Liu Jun(刘 军), Huang Hao(黄 昊), Sun Suqin(孙素琴). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2003, 31(9)： 1058～1061
11 Cheng Cungui(程存归), Wu Xiaohua(吴小华), Wang Senqing(王森清). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2004, 32(11)： 1421～1425
12 Golovina E A, Hoekstra F A. Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol., 2002, 131(3): 545～558
13 Wolkers W F, Oldenhof H, Tablin F, Crowe J H. Biochim. Biophys. Acta, 2004, 1661(2)： 125～134
14 Tomczak M M, Hincha D K, Estrada S D, Wolkers W F, Crowe L M, Feeney R E, Tablin F, Crowe J H. Biophys. J., 2002, 82(2) ： 874～881
15 Wolkers W F, Tetteroo F A, Alberda M, Hoekstra F A. Plant Physiol., 1999, 120(1)： 153～164
16 Oliver M J, Dowd S E, Zaragoza J, Mauget S A, Payton P R. BMC Genomics, 2004, 5(1)： 89～94
17 Oliver M J, Velten J, Mishler B D. Integrative and Comparative Biology, 2005, 45(5)： 788～799
本文系国家自然科学基金资助项目(No.30371002)
(上海交通大学环境科学与工程学院,上海 200240)
(中国科学院上海有机化学研究所,上海 200032), 百拇医药(许书军 王艳 陈颖雯 蔡伟民 陈蔚红)
关键词 质膜结构，耐热性，自旋标记，原位红外，刺叶墙藓
1 引言
研究荒漠苔藓植物对逆境胁迫适应性，不仅有助于人工培育生物结皮保护生态环境，还可以利用苔藓植物抗逆基因改良农作物。随着全球环境变化，我国西北地区气候正面临从干热到湿热型转变，而且年平均温度以0.2℃增加[1]。沙漠土壤表层间歇性高温对荒漠苔藓在沙漠地区分布产生选择压力，特别是水合生长繁殖期间。水合组织在热胁迫超过40℃,组织遭受破坏，短时间(30 min以内)暴露于42～51℃下将造成大部分苔藓死亡，主要由于高温造成细胞膜结构破坏，溶质渗漏导致细胞死亡[2]。而墙藓类能够在期间存活[3]，热处理后不同叶龄叶片繁殖能力存在显著差异，其减少损伤和自我保护机理尚不完全清楚。利用生物化学方法研究苔藓质膜热胁迫响应存在诸多缺陷[4～6]，而电子顺磁共振波谱 (EPR)自旋标记和傅立叶变换显微红外光谱 (FTIR microscope)在研究逆境对生物膜组成和结构方面，比传统生理生化方法具有更简单前处理和更高精确度[7,8]。FTIR方法广泛应用于医学 [9～11]，用于植物组织膜结构对环境胁迫响应是近几年国内外研究热点[12～15]；EPR研究集中在干燥对种子和花粉质膜透性的影响[12,13]，应用于营养体高温胁迫研究尚未见报道。本研究选择古尔班通古特沙漠分布相对广泛的耐干性苔藓刺叶墙藓(Tortula desertorum)作为研究材料，利用EPR和原位红外探讨了短时高温对荒漠苔藓叶片和原丝体水合组织膜结构的影响。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂及材料BrukerEMX8 EPR(Bruker BioSpin Corp.， Germany)、BIORAD FT185 FTIR Microscope (内装液氮冷却的窄带MCT检测器,美国Varan Corp.公司)、真空干燥箱、真空抽滤机、培养箱(江南仪器厂)。TEMPONE (4氧2，2，6，6四甲基吡啶)、K3[Fe(CN)3]、D2O(Sigmaaldrich Corp.，USA)。供试材料为刺叶墙藓(T.desertorum)，经上海师范大学曹同教授鉴定，采集自新疆古尔班通古特沙漠相邻土壤结皮。
2.2 实验方法
2.2.1 不同组织获得及生物热胁迫 野外采集刺叶墙藓雌配子体经过48 h直接水合后，按照Stark [3]叶龄划分标准， 将刺叶墙藓叶片分为幼叶(1年生)、绿叶(4年生)、黄绿叶(6年生)、黄叶(10年生)。叶片用Knop固体培养基(1.0 g/L Ca(NO3)2·4H2O、 0.25 g/L KH2PO4、 0.12 g/L KCl、 0.25 g/L MgSO4·7H2O 以及微量FeCl3·6H2O)室内培养。 培养条件设置为：湿度90%，光照时间为14 h/d，昼夜温度为20℃/10℃，光照强度为85～120 PPFD。不同叶龄水合组织45℃水浴加热1 h后备用。
2.2.2 自旋标记EPR测定 分别配置100 mL 的1 mmol TEMPONE、120 mmol K3[Fe(CN)6]溶液，保存于0～4℃冰箱。材料浸入TEMPONE溶液，轻微摇动后静置20 min，然后加入K3[Fe(CN)6]溶液，静置10 min，抽滤至表面无水后载入2 mm毛细管，放入EPR采样器测定。为增加信噪比，固定测量参数采集3次取平均值。
2.2.3 原位显微红外测定 材料在通风橱自然干燥48 h，样品相对含水量(WC)控制在0.1 g/g DW(DW为干重)以内。干燥组织用金属片压薄，厚度10~15 μm，尽量保证叶片完整。为了检验干燥处理对材料的影响，新鲜叶片用D2O浸泡2 h，旋转蒸发去表面D2O后直接采谱。以银为反射参比，分辨率4 cm-1，150次扫描累加。所得光谱是采集谱和现时采集的水汽以及CO2谱的差谱。所有光谱采集面积固定为150 μm×150 μm，每个样品采集3个点，重复两个样品，结果只显示其中一条代表性光谱。采用BioRad自带软件对红外光谱进行傅立叶自解卷积和二阶导数处理，进行拟合分峰，计算峰面积，面积取6次测量平均值以减少误差。
3 结果与讨论
3.1 热胁迫对膜透性的影响刺叶墙藓EPR测定谱图是极性区细胞质和疏水区TEMPONE分子两个信号的叠加(图1)。K3[Fe(CN)6] 能够屏蔽膜外TEMPONE信号，但不能够穿透完整细胞膜，所以非极性区以内TEMPONE分子信号没有被屏蔽。如果细胞膜有一定程度破损，K3[Fe(CN)6]将穿透细胞膜进入极性区，屏蔽细胞质内TEMPONE信号。K3[Fe(CN)6] 不能进入非极性脂质层内部，所以TEMPONE脂质峰(lipid peak， L)值可以作为内标。脂质峰与细胞质峰(water peak， W)线高比值由穿透细胞膜进入细胞质的K3[Fe(CN)6]量决定，可用来评价质膜透性，方程为：P＝L/W(1) 其中P为质膜渗透性强度，L为脂质峰高，W为 细胞质峰高。L/W值越高，表明细胞质膜透性越强，可以用来评价生物与环境胁迫之间损伤和自我保护关系[12]。比较其它不同生长时间的叶片L/W值(图2A)发现，处理前组织L/W值随组织生长时间缓慢增加，数值在0.10以内；处理后L/W值都在0.15以上，能够明显区别各叶龄细胞膜透性强度，证明利用L/W值作为质膜透性强度比传统的电导率法精确，能够区分微小差异。以处理前后L/W值作比作为衡量热胁迫膜损伤强度(图2B)，发现质膜损伤强度同生长时间显著负相关(r=0.88)，方程为:Y=5.13-0.28X(2) 其中X为生长时间。实验表明，在高温胁迫下刺叶苔藓幼嫩叶片质膜透性易受影响，这可能与其缺乏环境锻炼有关。
图1 刺叶墙藓次生叶热处理前后TEMPONE信号的 EPR谱(略)
Fig.1 Representative electron paramagnetic resonance (EPR) spectra of 4oxo2,2,6,6tetraethyl1piperidinyloxy (TEMPONE) in secondary leaves before and after thermostress
图2 荒漠苔藓不同叶龄组织热处理前后质膜透性(a)和质膜透性变化强度与叶龄相关关系(b)(略)
Fig.2 Plasma membrane permeability in different aging leaves of the desert moss T. desertorum before and after thermostress (a) and the relationship between ratio of permeability and leaf age (b)
P. 原丝体(protonema)； S. 次生叶(secondary leaf); J. 幼叶(juvenile leaf); G. 绿叶(green leaf); GY. 黄绿叶(greenyellow leaf); Y. 黄叶(yellow leaf)。
3.2 刺叶墙藓红外指纹图谱刺叶墙藓组织红外吸收光谱和二阶倒数谱(图3)表明，在3400 cm-1附近的吸收峰为OH和NH化学键伸缩振动谱带，表明组织内部含有大量的蛋白质和多糖类(图3A)。2928 cm-1附近为CH伸缩振动带，主要碳氢化合物存在引起。CH变角振动吸收位于1200～1500 cm-1之间，往往与其他吸收峰重叠。蛋白特征吸收区域存在于1658 cm-1(CO，酰胺Ⅰ带)、1560 cm-1(NH，酰胺Ⅱ带)和1260 cm-1(CN，酰胺Ⅲ带)。二阶导数处理后(图3B)明显可以观察到1728 cm-1处吸收峰，以及酰胺Ⅰ带存在5个吸收峰。
图3 刺叶墙藓次生叶红外吸收光谱(4000～1000 cm-1)(a)二阶导数谱图(b)(略)
Fig.3 Absorption spectra in the region of 4000 to 1000 cm-1 (a) and secondderivative spectra (b) of the desert moss T. desertorum secondary leaves
1，2分别代表热处理前后吸收谱，箭头标明显著变化(number of 1 and 2 represented spectra before and after thermostress respectively, an arrow indicated a significant change)。
热处理后幼叶在1728 cm-1附近为COOR特征吸收峰增强，主要表现为细胞壁胶质和细胞膜质结构内化合物变化。D2O取代水分测定结果显示，缓慢干燥对野生叶酯基吸收峰、酰胺 Ⅰ带影响甚小，可能与刺叶墙藓强耐干性有关，而对次生叶叶片脂基峰有影响，表明新生组织同野生在耐干性方面存在差异。
3.3 热胁迫对膜蛋白二级结构影响1700～1600 cm-1区域内的红外谱图为蛋白质酰胺Ⅰ带，运用傅立叶解卷积和拟合分峰将酰胺Ⅰ带分为1613、1631、1641、1659、1678和1690 cm-1等峰。对苔藓叶片膜蛋白二级结构进行指认[8,15]，确定1659 cm-1吸收峰为α螺旋，1631，1678 和1691 cm-1为α折叠和转角结构，1641 cm-1为无规则卷曲。刺叶墙藓不同叶龄间热处理前后蛋白质主要组成α螺旋和β折叠(含β转角)含量由49%～61%、34%～39%转变为54%～70%、24%～38%(见表1)，变化比较明显。热处理后每种水合组织不同程度上蛋白质二级结构都发生变化。原丝体和次生叶α螺旋含量热处理后分别增加40%和16%，相应β折叠含量相应减少；其他叶龄叶片 α螺旋和β折叠(含β转角)含量都有所增加，但变化范围不大，蛋白质二级结构相对稳定。蛋白质二级结构变化与膜透性结果比较发现，高温对组织膜透性的影响与膜蛋白二级结构变化情况呈正比(图2，表1)，说明蛋白质结构稳定有助于减少膜透性。同时组织间蛋白质二级结构各成分含量差异较大(表1)，证明不同叶龄组织蛋白质成分不同。老龄组织可能含有不同于新生组织的耐热性蛋白，使得其蛋白质结构比新生组织更加稳定。土生墙藓(tortula ruralis)在干燥胁迫时合成大量的LEA蛋白，水合时合成水合蛋白(hydrinlike proteins )，保护细胞在脱水或者水合膜结构[16,17]。同属的刺叶墙藓膜蛋白质二级结构热稳定是否与这类蛋白有关，有待进一步证明。
表1 刺叶墙藓不同叶龄组织45℃热处理前后蛋白质二级结构变化(略)
Table 1 Change of the secondary structure of different aging tissues of T. desertorum before and after treating at 45℃
4 结论
荒漠苔藓不同生长期水合组织对45℃热胁迫产生不同响应。EPR研究结果说明荒漠苔藓膜透性变化程度与叶龄呈显著负相关(r=0.88)。运用解卷积和分峰处理FTIR谱显示，不同叶龄组织膜蛋白二级结构α螺旋、β折叠等含量在叶龄间变化比较大，说明不同叶龄蛋白质成分不相同；原丝体、次生叶的蛋白质结构比其它叶龄对高温胁迫更为敏感。比较EPR和FTIR研究结果表明，膜透性强弱与蛋白质二级结构热稳定性有关，蛋白质结构越稳定，膜透性在热胁迫后变化越小。
致 谢 感谢中国科学院新疆生态与地理研究所张元明研究员和ElenaA.Golovina博士(Russian Academy of Sciences)给予的帮助。
References
1 Shi Yafeng(施雅风), Shen Yongping(沈永平). Science and Technology Review(科技导报), 2003, (2)： 54～57
2 Meyer H, Santarius K A. Oecologia, 1998, 11(5)： 1～8
3 Stark L R, McLetchie D N. Physiologia Plantarum, 2006, 126(2)： 187～195
4 Liu Y, Cao T, Glime J M. Bryologist, 2003, 106： 53～60
5 Liu Y, Li Z, Cao T, Glime J M. Journal of Bryology, 2004, 26： 265～271
6 Platt K A, Oliver M J, Thomson W W. Protoplasma, 1994, 178： 57～65
7 Wood A J, Duff R J, Oliver M J. Journal of Experimental Botany, 2001, 51(351)： 1655～1662
8 Yang J, Yen H E. Plant Physiol., 2002, 130(2)： 1032～1042
9 Sun Suqin(孙素琴), Liu Jun(刘 军), Zhou Qun(周 群). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2002, 30(2)： 140～143
10 Zhou Qun(周 群), Li Jing(李 静), Liu Jun(刘 军), Huang Hao(黄 昊), Sun Suqin(孙素琴). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2003, 31(9)： 1058～1061
11 Cheng Cungui(程存归), Wu Xiaohua(吴小华), Wang Senqing(王森清). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2004, 32(11)： 1421～1425
12 Golovina E A, Hoekstra F A. Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol., 2002, 131(3): 545～558
13 Wolkers W F, Oldenhof H, Tablin F, Crowe J H. Biochim. Biophys. Acta, 2004, 1661(2)： 125～134
14 Tomczak M M, Hincha D K, Estrada S D, Wolkers W F, Crowe L M, Feeney R E, Tablin F, Crowe J H. Biophys. J., 2002, 82(2) ： 874～881
15 Wolkers W F, Tetteroo F A, Alberda M, Hoekstra F A. Plant Physiol., 1999, 120(1)： 153～164
16 Oliver M J, Dowd S E, Zaragoza J, Mauget S A, Payton P R. BMC Genomics, 2004, 5(1)： 89～94
17 Oliver M J, Velten J, Mishler B D. Integrative and Comparative Biology, 2005, 45(5)： 788～799
本文系国家自然科学基金资助项目(No.30371002)
(上海交通大学环境科学与工程学院,上海 200240)
(中国科学院上海有机化学研究所,上海 200032), 百拇医药(许书军 王艳 陈颖雯 蔡伟民 陈蔚红)