p53基因第7内含子序列的多态性位点分析
顾其华 舒畅 叶爱慧 吕新生 唐孝亮 况艳春
摘 要 目的 测定中国人p53基因内含子7序列的多态性位点。 方法 收集105名正常人外周血标本，用聚合酶链反应扩增p53基因第7内含子，用双链四色荧光标记测序方法进行序列分析。结果 在p53基因第7内含子上，距外显子7最后一个碱基73 bp处有1个C和T多态位点、距93 bp处有1个T和G多态位点，其中基因型呈TG型的22例，呈CT型的37例，CT/TG杂合型的46例，未发现基因型为TT和CG单体型的个体。前一个多态位点有1个ApaⅠ酶切位点的变化。基因频率为：CT=0.57，TG=0.43。结论 p53基因内含子7上有2个多态性位点，且这两个多态性位点属于连锁不平衡，这在亲缘关系和法医鉴定等方面有重要价值。
关键词：p53基因；内含子；多态性位点
p53基因是人类进化上的高度保守基因，位于人染色体17p1.3上，有11个外显子和10个内含子[1]。国内外关于p53基因突变与肿瘤的关系研究较多[2]，我们对肿瘤标本p53基因外显子7和8序列进行分析时，发现第7内含子上、距外显子7最后1个碱基对73 bp处有1个C和T的多态，93 bp处有1个T和G的多态，与肿瘤无关。进一步对105名正常人进行序列分析，证实在正常人p53基因内含子7有两个多态位点，且前一个多态位点处有1个ApaⅠ酶切位点的变化，这在亲缘关系和法医鉴定等方面有重要价值。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本 105名正常人，无亲缘关系，抽0.5 ml静脉血，用EDTA钠抗疑。
1.2 材料 310型DNA测序仪、2400型热循环仪，四色荧光末端标记测序试剂盒、序列胶、分析缓冲液、模板抑制剂等由美国Perkin-Elmer公司产，TaqDNA聚合酶、扩增缓冲液、dNTP等由加拿大Sangon公司产，电泳级琼脂糖由中国科学院上海药物所产，引物由中国科学院上海生工公司产，其他试剂采用国产分析纯试剂配制而成。
1.3 方法 引物序列分别为引物1：5′-TGTTGT-CTCCTAGGTTGGCTCTGACTA-3′；引物2：5′-GT-CCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTGC-3′。扩增长度包括外显子7、8和其间的内含子7。标本用双蒸水溶血、离心取白细胞核沉淀，用含蛋白酶K、乙二胺四乙酸二钠的消化缓冲液混匀，于50 ℃水浴中消化2 h，用苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA，取1 μg基因组DNA、15 mmol/L的氯化镁5 μl、10×缓冲液5μl、2 mmol/L的dNTP 5μl、引物1和2各25 pmol、ddHO适量配成50 μl反应体系进行扩增。条件为：96 ℃预变性7 min；94 ℃下加入Taq DNA聚合酶5 U，94 ℃变性30 s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，循环35次；最后72 ℃充分延伸7 min。扩增产物用琼脂糖电泳，紫外光鉴定质量，直接从琼脂糖胶中回收产物，用四色荧光单道测序法对双链产物直接测序，正链、反链两次测序即可测完外显子7、8和其间的内含子7序列。
, 百拇医药
2 结果
全部标本的外显子7和8的碱基序列均与国外测定的标准序列相同，内含子7序列出现3种结果，即距外显子7最末一位碱基73 bp处发有C、T、CT杂合3种变异；距93 bp处有T、G、TG杂合3种变异，结果中只出现CT、TG、CT/TG杂合3种基因型，未发现CG和TT单体，表明这两个多态位点属于连锁不平衡，基因频率CT=0.57、TG=0.43(表1，图1)。内含子7其余碱基序列则稳定不变。
表1 p53基因内含子7上的两个多态性位点分布情况
Table 1 Distributions of the two polymorphic points of p53 gene intron 7
Samples
(标本数)
, 百拇医药
73 bp to exon 7
(73 bp处)
93 bp to exon 7
(93 bp处)
Genotypes
(基因型)
Cases
(例数)
Frequency
(频率)…GGGCCC……TTTCTT…
CT
37
, 百拇医药
0.35
105…GGGTCC……TTTCTG…
TG
22
0.21…GGGC(T)CC…TTTCTT(G)…
CT/TG
46
0.44
3 讨论
p53基因是一个抑癌基因，通常情况下有抑制肿瘤发生的作用[1]，突变后的p53基因则失去肿瘤抑制功能，还具有促使肿瘤发生的作用[3]。p53基因的序列已由国外测定，有11个外显子和10个内含子[4]，突变一般发生在外显子5～8[5]，故研究这几个外显子者较多，研究涉及内含子者少，研究其第7内含子多态性的尚未见报道。我们在做序列分析时，因采用双链直接测序方法，将1对引物分别设在外显子7上游和外显子8下游，扩增和测序长度包括外显子7、8和内含子7。因此，发现该内含子上有两个多态位点与肿瘤无关，与亲缘关系有关，且前一个多态位点有GGGCCC和GGGTCC及其杂合型3种基因型，构成1个ApaⅠ酶切位点的变化。
, 百拇医药
图1 p53基因内含子7序列片段 箭头所指为多态位点，a：TG型；b：CT型；c:CT/TG型
Fig 1 A fragment of p53 gene intron 7 Arrows mark the polymorphic point, a:type TG; b:type CT; C:type CT/TG
在亲缘关系和法医鉴定方面，常用ABO血型作为判断依据，但人群中血型相同者多，亲缘关系排除率不高，且很多情况下需要肯定父母中一方亲缘关系作为前提。近年来根据基因DNA多态性，在解决靠血型不能确定的亲缘问题方面有很大的优势，研究较多的有HLA基因等。我们发现的p53基因内含子7上的两个多态位点在亲缘判断和法医鉴定等具有重要的潜在应用价值：(1)这两个变异位点与遗传有关，与肿瘤无关。(2)这两个多态位点固定，而外显子7、8和内含子7其余序列稳定不变，上、下游100～200 bp内GC分布均匀，便于设计引物。(3)前一个多态位点构成一个ApaⅠ酶切位点变化，应用时不一定要测序，可以将引物设计在这个位点两侧扩增，再用ApaⅠ内切酶消化，基因型为GGGCCC者电泳出现2条带、GGGTCC者出现1条带、杂合型者出现3条带。该方法简便实用。(4)p53基因是一个高度保守的基因，且位于常染色体上，影响因素少，便于取得稳定的结果。
, 百拇医药
通信作者：顾其华(E-mail:sc28846@public.cs.hn.cn)
作者单位：顾其华(418000湖南省 怀化市第一人民医院分子遗传研究室)
叶爱慧(418000湖南省 怀化市第一人民医院分子遗传研究室)
唐孝亮(418000湖南省 怀化市第一人民医院分子遗传研究室)
况艳春(418000湖南省 怀化市第一人民医院分子遗传研究室)
舒畅(湖南医科大学附属湘雅医院外科教研室)
吕新生(湖南医科大学附属湘雅医院外科教研室)
参考文献
, http://www.100md.com [1]Donehower LA, Bradlly A. The tumor suppression p53. Biochem Biophys Acta, 1993, 1155∶191.
[2]He YJ, Li MF, Shang XN, et al.The relationship between p53 mutation and esophageal cancer biological behavlor. Chin J Med Genet,1998,15∶1-4.[何友吉，李明发，单祥年，等.p53基因突变与食管癌生物学行为的关系.中华医学遗传学杂志，1998，15∶1-4.]
[3]Lane DP. p53 guardian of genome. Nature, 1992, 358∶15.
[4]Hartman A, Blasyzyk H, Mcgovern RM, et al. p53 gene mutations inside and outside of exon 5-8:the patterns differ in breast and other cancer. Oncogene, 1995, 10∶681.
[5]Buchman VL, Chumakov PM, Ninkina NN, et al. A variation in the structure of the protein-coding of human p53 gene. Gene, 1988, 70∶245., 百拇医药
摘 要 目的 测定中国人p53基因内含子7序列的多态性位点。 方法 收集105名正常人外周血标本，用聚合酶链反应扩增p53基因第7内含子，用双链四色荧光标记测序方法进行序列分析。结果 在p53基因第7内含子上，距外显子7最后一个碱基73 bp处有1个C和T多态位点、距93 bp处有1个T和G多态位点，其中基因型呈TG型的22例，呈CT型的37例，CT/TG杂合型的46例，未发现基因型为TT和CG单体型的个体。前一个多态位点有1个ApaⅠ酶切位点的变化。基因频率为：CT=0.57，TG=0.43。结论 p53基因内含子7上有2个多态性位点，且这两个多态性位点属于连锁不平衡，这在亲缘关系和法医鉴定等方面有重要价值。
关键词：p53基因；内含子；多态性位点
p53基因是人类进化上的高度保守基因，位于人染色体17p1.3上，有11个外显子和10个内含子[1]。国内外关于p53基因突变与肿瘤的关系研究较多[2]，我们对肿瘤标本p53基因外显子7和8序列进行分析时，发现第7内含子上、距外显子7最后1个碱基对73 bp处有1个C和T的多态，93 bp处有1个T和G的多态，与肿瘤无关。进一步对105名正常人进行序列分析，证实在正常人p53基因内含子7有两个多态位点，且前一个多态位点处有1个ApaⅠ酶切位点的变化，这在亲缘关系和法医鉴定等方面有重要价值。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 标本 105名正常人，无亲缘关系，抽0.5 ml静脉血，用EDTA钠抗疑。
1.2 材料 310型DNA测序仪、2400型热循环仪，四色荧光末端标记测序试剂盒、序列胶、分析缓冲液、模板抑制剂等由美国Perkin-Elmer公司产，TaqDNA聚合酶、扩增缓冲液、dNTP等由加拿大Sangon公司产，电泳级琼脂糖由中国科学院上海药物所产，引物由中国科学院上海生工公司产，其他试剂采用国产分析纯试剂配制而成。
1.3 方法 引物序列分别为引物1：5′-TGTTGT-CTCCTAGGTTGGCTCTGACTA-3′；引物2：5′-GT-CCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTGC-3′。扩增长度包括外显子7、8和其间的内含子7。标本用双蒸水溶血、离心取白细胞核沉淀，用含蛋白酶K、乙二胺四乙酸二钠的消化缓冲液混匀，于50 ℃水浴中消化2 h，用苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA，取1 μg基因组DNA、15 mmol/L的氯化镁5 μl、10×缓冲液5μl、2 mmol/L的dNTP 5μl、引物1和2各25 pmol、ddHO适量配成50 μl反应体系进行扩增。条件为：96 ℃预变性7 min；94 ℃下加入Taq DNA聚合酶5 U，94 ℃变性30 s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，循环35次；最后72 ℃充分延伸7 min。扩增产物用琼脂糖电泳，紫外光鉴定质量，直接从琼脂糖胶中回收产物，用四色荧光单道测序法对双链产物直接测序，正链、反链两次测序即可测完外显子7、8和其间的内含子7序列。
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2 结果
全部标本的外显子7和8的碱基序列均与国外测定的标准序列相同，内含子7序列出现3种结果，即距外显子7最末一位碱基73 bp处发有C、T、CT杂合3种变异；距93 bp处有T、G、TG杂合3种变异，结果中只出现CT、TG、CT/TG杂合3种基因型，未发现CG和TT单体，表明这两个多态位点属于连锁不平衡，基因频率CT=0.57、TG=0.43(表1，图1)。内含子7其余碱基序列则稳定不变。
表1 p53基因内含子7上的两个多态性位点分布情况
Table 1 Distributions of the two polymorphic points of p53 gene intron 7
Samples
(标本数)
, 百拇医药
73 bp to exon 7
(73 bp处)
93 bp to exon 7
(93 bp处)
Genotypes
(基因型)
Cases
(例数)
Frequency
(频率)…GGGCCC……TTTCTT…
CT
37
, 百拇医药
0.35
105…GGGTCC……TTTCTG…
TG
22
0.21…GGGC(T)CC…TTTCTT(G)…
CT/TG
46
0.44
3 讨论
p53基因是一个抑癌基因，通常情况下有抑制肿瘤发生的作用[1]，突变后的p53基因则失去肿瘤抑制功能，还具有促使肿瘤发生的作用[3]。p53基因的序列已由国外测定，有11个外显子和10个内含子[4]，突变一般发生在外显子5～8[5]，故研究这几个外显子者较多，研究涉及内含子者少，研究其第7内含子多态性的尚未见报道。我们在做序列分析时，因采用双链直接测序方法，将1对引物分别设在外显子7上游和外显子8下游，扩增和测序长度包括外显子7、8和内含子7。因此，发现该内含子上有两个多态位点与肿瘤无关，与亲缘关系有关，且前一个多态位点有GGGCCC和GGGTCC及其杂合型3种基因型，构成1个ApaⅠ酶切位点的变化。
, 百拇医药
图1 p53基因内含子7序列片段 箭头所指为多态位点，a：TG型；b：CT型；c:CT/TG型
Fig 1 A fragment of p53 gene intron 7 Arrows mark the polymorphic point, a:type TG; b:type CT; C:type CT/TG
在亲缘关系和法医鉴定方面，常用ABO血型作为判断依据，但人群中血型相同者多，亲缘关系排除率不高，且很多情况下需要肯定父母中一方亲缘关系作为前提。近年来根据基因DNA多态性，在解决靠血型不能确定的亲缘问题方面有很大的优势，研究较多的有HLA基因等。我们发现的p53基因内含子7上的两个多态位点在亲缘判断和法医鉴定等具有重要的潜在应用价值：(1)这两个变异位点与遗传有关，与肿瘤无关。(2)这两个多态位点固定，而外显子7、8和内含子7其余序列稳定不变，上、下游100～200 bp内GC分布均匀，便于设计引物。(3)前一个多态位点构成一个ApaⅠ酶切位点变化，应用时不一定要测序，可以将引物设计在这个位点两侧扩增，再用ApaⅠ内切酶消化，基因型为GGGCCC者电泳出现2条带、GGGTCC者出现1条带、杂合型者出现3条带。该方法简便实用。(4)p53基因是一个高度保守的基因，且位于常染色体上，影响因素少，便于取得稳定的结果。
, 百拇医药
通信作者：顾其华(E-mail:sc28846@public.cs.hn.cn)
作者单位：顾其华(418000湖南省 怀化市第一人民医院分子遗传研究室)
叶爱慧(418000湖南省 怀化市第一人民医院分子遗传研究室)
唐孝亮(418000湖南省 怀化市第一人民医院分子遗传研究室)
况艳春(418000湖南省 怀化市第一人民医院分子遗传研究室)
舒畅(湖南医科大学附属湘雅医院外科教研室)
吕新生(湖南医科大学附属湘雅医院外科教研室)
参考文献
, http://www.100md.com [1]Donehower LA, Bradlly A. The tumor suppression p53. Biochem Biophys Acta, 1993, 1155∶191.
[2]He YJ, Li MF, Shang XN, et al.The relationship between p53 mutation and esophageal cancer biological behavlor. Chin J Med Genet,1998,15∶1-4.[何友吉，李明发，单祥年，等.p53基因突变与食管癌生物学行为的关系.中华医学遗传学杂志，1998，15∶1-4.]
[3]Lane DP. p53 guardian of genome. Nature, 1992, 358∶15.
[4]Hartman A, Blasyzyk H, Mcgovern RM, et al. p53 gene mutations inside and outside of exon 5-8:the patterns differ in breast and other cancer. Oncogene, 1995, 10∶681.
[5]Buchman VL, Chumakov PM, Ninkina NN, et al. A variation in the structure of the protein-coding of human p53 gene. Gene, 1988, 70∶245., 百拇医药