白芍水提部位化学成分的HPLC—ESI—Q—TOF—MS分析(1)
[摘要]该实验通过HPLC-ESI-Q-TOF-MS技术对白芍水提取部分中的化学成分进行定性分析。采用C18色谱柱(Hanbon LichrospherTM，4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相梯度洗脱；质谱使用ESI离子源，正离子与负离子模式下采集数据，通过分析正、负离子质谱信息及元素组成，并与相关文献数据比对，共鉴定出11个化合物。实验利用了HPLC的高效分离和MS的高灵敏检测优势，为阐明白芍水提部分的药效物质基础提供有力的依据。
[关键词]白芍；化学成分；HPLC-ESI-Q-TOF-MS
[稿件编号] 20130114006
[基金项目] 江苏高校优势学科建设工程项目(2011ZYX6-014)，江苏省2012年度普通高校研究生科研创新计划项目(CXZZ12-0626)
, 百拇医药
[通信作者] *李祥，教授，博士生导师，Tel：(025)85811512，E-mail：lixiang_8182@163.com
[作者简介] 孙东东，博士研究生，助理研究员，主要从事中药活性物质分析及药效机制研究，Tel：(025)85811001，E-mail：sun_21373@163.com
白芍Paeoniae Radix Alba为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.干燥根，性微苦，味苦酸，有养血柔肝，缓中止痛，敛阴收汗的功能[1]。白芍中含有多种化学成分，包括单萜及其苷类、黄酮、鞣质、多糖等，有抗炎、免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗惊厥、胃肠道疾病、护肝和心血管疾病等的药理作用。当前针对白芍的化学成分分离鉴定主要还是以硅胶等色谱分离为主，并通过核磁、质谱等波谱分析手段鉴定其结构[2-3]；而常规的化学分析主要采用紫外分光光度法、高效液相色谱法、薄层色谱扫描法，以及毛细管电泳法等，很少利用LC-MS/MS联用技术[4]。LC-MS/MS联用技术兼具了液相色谱的高效分离特性以及质谱的高灵敏检测优势[5]，使其在化学成分研究分析中的应用正逐渐增多，为进一步明确白芍的抗炎、免疫调节有效成分及物质基础，本文采用LC-MS/MS技术，对白芍水提取部分中的主要化学成分进行鉴定，为下一步的药效活性研究提供基础。
, http://www.100md.com
1 材料
AB SCIEX Triple Tof 5600 质谱仪(美国AB公司)；岛津LC-20A快速液相(配有DGU-20A3在线脱气机，LC-20AD XR泵，SIL-20A XR 自动进样器及CTO-20AC柱温箱，日本Shimadzu公司)；分析软件：Analyst TF1.6 software，Shortcut to peskview；FA1104N 1/1万电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；EPED超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司)；色谱甲醇(HPLC，江苏汉邦科技有限)；甲酸(分析纯，Merck公司)；超纯水(自制)。白芍药材采于安徽，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为毛茛科植物芍药P. lactiflora的干燥根。
2 方法
2.1 液相检测条件 Hanbon LichrospherTM HPLC C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B)；梯度洗脱0～5min，10%A；5～10 min，10%～30%A；10～15 min，30%～85%A；15～20 min，85%～100%A；20～23 min，100%A；23～25min，100%～10%A；24～30 min，10%；柱温40 ℃；流速1.0 mL·min-1；进样量10 μL。
, http://www.100md.com
2.2 质谱检测条件 电喷雾离子源(ESI)，正、负离子模式，多反应监测(MRM)；离子喷雾电压(Ion Spray voltage，IS)分别为5 500，4 500 V；去簇电压(declustering potential，DP)分别为80，-80 V；碰撞电压 (collision，CE)分别为45.0，-30.0 V；雾化气(ion source gas 1)379.23 kPa； 辅助加热器(ion source gas 2) 379.23 kPa。气帘气(CUR)为275.80 kPa；去溶剂温度(TEM)为500.00 ℃；TOF MASSES(DA)：Min=100.000 0，Max=1 200.000 0；碰撞活化扫描(collisional excitation scanning，CES) 为20.0。
2.3 样品溶液的制备称取79.5 g白芍药材，加入8倍量水，煎煮3次，每次分别1，1，0.5 h过滤，合并滤液，合并后水提取液体积1 000 mL，再加入1 100 mL 95%乙醇密封，静置48 h后，抽滤取上清液，将上清液放在80 ℃水浴锅上烘干。烘干恒重后，称取0.100 0 g用50%甲醇定容到100 mL，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
3 结果
3.1 LC-MS成分鉴定 用LC-MS/MS对白芍水提取部分中化学成分进行定性分析，(-)ESI-MS和(+)ESI-MS的质谱总离子流图(TIC)见图1。
图1 白芍水提取部分中负离子(A)和正离子(B)模式的总离子流图
Fig.1 The total ion current chromatogram in negative (A) and positive (B)ion mode for water extract of Paeoniae Radix Alba, 百拇医药(孙东东,徐晓芳,崔九成,宋小妹,李祥)
[关键词]白芍；化学成分；HPLC-ESI-Q-TOF-MS
[稿件编号] 20130114006
[基金项目] 江苏高校优势学科建设工程项目(2011ZYX6-014)，江苏省2012年度普通高校研究生科研创新计划项目(CXZZ12-0626)
, 百拇医药
[通信作者] *李祥，教授，博士生导师，Tel：(025)85811512，E-mail：lixiang_8182@163.com
[作者简介] 孙东东，博士研究生，助理研究员，主要从事中药活性物质分析及药效机制研究，Tel：(025)85811001，E-mail：sun_21373@163.com
白芍Paeoniae Radix Alba为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.干燥根，性微苦，味苦酸，有养血柔肝，缓中止痛，敛阴收汗的功能[1]。白芍中含有多种化学成分，包括单萜及其苷类、黄酮、鞣质、多糖等，有抗炎、免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗惊厥、胃肠道疾病、护肝和心血管疾病等的药理作用。当前针对白芍的化学成分分离鉴定主要还是以硅胶等色谱分离为主，并通过核磁、质谱等波谱分析手段鉴定其结构[2-3]；而常规的化学分析主要采用紫外分光光度法、高效液相色谱法、薄层色谱扫描法，以及毛细管电泳法等，很少利用LC-MS/MS联用技术[4]。LC-MS/MS联用技术兼具了液相色谱的高效分离特性以及质谱的高灵敏检测优势[5]，使其在化学成分研究分析中的应用正逐渐增多，为进一步明确白芍的抗炎、免疫调节有效成分及物质基础，本文采用LC-MS/MS技术，对白芍水提取部分中的主要化学成分进行鉴定，为下一步的药效活性研究提供基础。
, http://www.100md.com
1 材料
AB SCIEX Triple Tof 5600 质谱仪(美国AB公司)；岛津LC-20A快速液相(配有DGU-20A3在线脱气机，LC-20AD XR泵，SIL-20A XR 自动进样器及CTO-20AC柱温箱，日本Shimadzu公司)；分析软件：Analyst TF1.6 software，Shortcut to peskview；FA1104N 1/1万电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；EPED超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司)；色谱甲醇(HPLC，江苏汉邦科技有限)；甲酸(分析纯，Merck公司)；超纯水(自制)。白芍药材采于安徽，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为毛茛科植物芍药P. lactiflora的干燥根。
2 方法
2.1 液相检测条件 Hanbon LichrospherTM HPLC C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B)；梯度洗脱0～5min，10%A；5～10 min，10%～30%A；10～15 min，30%～85%A；15～20 min，85%～100%A；20～23 min，100%A；23～25min，100%～10%A；24～30 min，10%；柱温40 ℃；流速1.0 mL·min-1；进样量10 μL。
, http://www.100md.com
2.2 质谱检测条件 电喷雾离子源(ESI)，正、负离子模式，多反应监测(MRM)；离子喷雾电压(Ion Spray voltage，IS)分别为5 500，4 500 V；去簇电压(declustering potential，DP)分别为80，-80 V；碰撞电压 (collision，CE)分别为45.0，-30.0 V；雾化气(ion source gas 1)379.23 kPa； 辅助加热器(ion source gas 2) 379.23 kPa。气帘气(CUR)为275.80 kPa；去溶剂温度(TEM)为500.00 ℃；TOF MASSES(DA)：Min=100.000 0，Max=1 200.000 0；碰撞活化扫描(collisional excitation scanning，CES) 为20.0。
2.3 样品溶液的制备称取79.5 g白芍药材，加入8倍量水，煎煮3次，每次分别1，1，0.5 h过滤，合并滤液，合并后水提取液体积1 000 mL，再加入1 100 mL 95%乙醇密封，静置48 h后，抽滤取上清液，将上清液放在80 ℃水浴锅上烘干。烘干恒重后，称取0.100 0 g用50%甲醇定容到100 mL，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
3 结果
3.1 LC-MS成分鉴定 用LC-MS/MS对白芍水提取部分中化学成分进行定性分析，(-)ESI-MS和(+)ESI-MS的质谱总离子流图(TIC)见图1。
图1 白芍水提取部分中负离子(A)和正离子(B)模式的总离子流图
Fig.1 The total ion current chromatogram in negative (A) and positive (B)ion mode for water extract of Paeoniae Radix Alba, 百拇医药(孙东东,徐晓芳,崔九成,宋小妹,李祥)