灯盏花查尔酮合成酶基因表达与灯盏乙素含量关系的研究(1)
[摘要] 目的：灯盏花的有效成分灯盏乙素是一种具有显著药理活性的黄酮类化合物，目前仍缺乏对其合成途径的相关认识。查尔酮合成酶(CHS)是黄酮类生物合成的一个关键酶，该研究旨在通过研究CHS表达水平与灯盏花中各组织灯盏乙素含量的变化规律，阐明该基因的表达模式与灯盏乙素含量之间的关系。
方法：通过RT-PCR及RACE方法从灯盏花中克隆CHS基因全长，利用荧光定量PCR方法检测该基因在灯盏花各组织中的表达量，采用HPLC分析各组织中灯盏乙素的含量。
结果：序列全长1 270 bp，编码405氨基酸，该基因DNA序列与菊科植物的同源基因相似性在80%左右，荧光定量显示CHS在叶中表达量最高，远高于根、茎和花；HPLC发现灯盏乙素在叶中含量最高，其次是花和茎，而在根中未检测到。
结论：相关性分析表明CHS相对表达量与灯盏花不同部位灯盏乙素含量间呈正相关关系(r=0.761，P<0.05)，说明灯盏乙素的生成与CHS基因的表达密切相关。
, 百拇医药
[关键词]灯盏花；灯盏乙素；查尔酮合成酶灯盏花Erigeron breviscapus (Vant.) Hand.-Mazz.是为菊科飞蓬属多年生草本植物[1]，具有散寒解表、祛风除湿、活血化瘀、通经活络、消炎止痛的功效。灯盏乙素是灯盏花的主要药用成分[2]， 是类黄酮代谢途径中前面几步的代谢产物。
现已知植物中查尔酮合酶是类黄酮途径的第一个关键酶，它可以催化1分子4-香豆酰-CoA与3分子丙二酰-CoA缩合形成柚苷配基查尔酮。柚苷配基查尔酮是花青苷类色素和植物黄酮类物质合成的前体[3] ，CHS是植物黄酮、异黄酮类物质合成的限速酶，该酶的表达受UV照射[4]、真菌侵染等条件诱导[5]。目前，GenBank注册的与CHS有关的核酸序列已经有5 000多条，涉及到的植物主要是豆科的大豆Glycine max、苜蓿Medicago sativa、豌豆Pisum sativum；十字花科的拟南芥Arabidopsis thaliana；禾本科的水稻Oryza sativa、玉米Zea mays；葡萄科的葡萄Vitis vinifera等。
, 百拇医药
目前灯盏花的人工引种栽培过程中存在繁殖慢，成活率低，尤其是品质不稳定甚至退化等问题，同时由于有效成分灯盏乙素在全药材中的含量很低，在一定程度上也降低了灯盏花药材大面积种植的附加值，增加了投入成本。尽管前人曾报道利用化学合成的方法来合成灯盏乙素[6]，但化学合成存在原料成本高和化学污染等问题，至今未实现工厂化生产。
因此，在充分了解灯盏花中灯盏乙素合成机制的基础上采用基因工程的方法生产灯盏乙素将是未来发展的一个重要方向。到目前为止，灯盏花中查尔酮合成酶(CHS)基因已被成功克隆[7]，但关于它的基因表达量与灯盏乙素含量关系的研究至今仍未报道。
本研究拟以灯盏花为材料，克隆灯盏花CHS基因，利用荧光定量技术探讨不同部位CHS表达量，同时利用HPLC方法检测不同部位的灯盏乙素含量，采用相关性分析探讨CHS基因表达与灯盏乙素合成之间的关系，为研究灯盏乙素生物合成的分子过程及调控机制奠定基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 供试材料与cDNA的合成 采集灯盏花新鲜根、茎、叶、花，用于总RNA提取的材料保存于-70 ℃冰箱备用；用于高效液相实验的根、茎、叶、花于40 ℃的干燥箱，待烘干后用粉碎机打粉成100目备用。采用Plant RNA Isolation Kid (Promega) 提取灯盏花的根、茎、叶、花的总RNA。cDNA合成方法参照Promega 公司提供的Reverse Transcription System操作手册进行。
1.2 引物设计与CHS cDNA全序列的获得 根据GenBank中下载的CHS基因序列采用Primer 5.0 软件设计。序列为F：5′-GCGATAACACAAGTCCTTCC-3′；R：5′-ATGATACTGGCAGGGTGGT-3′；配制PCR反应体系：cDNA(1∶10) 2 μL，10×PCR buffer 5 μL，10 mmol·L-1dNTP mix 1 μL，引物各1.5 μL，rTaq酶加入0.5 μL，用ddH2O补足至50 μL。PCR扩增反应程序如下：94 ℃变性3 min；94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后送至天跟生化科技公司测序。
, http://www.100md.com
5′RACE以CHS核心基因片段为模板，Primer 5.0设计5′RACE反应引物，5CHS：5′-GGTGCAGAAGATGAGATGAGTGA-3′，按照BD SMARTM RACE cDNA amplification kit操作。5′RACE的PCR条件：94 ℃ 30 s；68 ℃ 30 s；72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 8 min， 1个循环；4 ℃终止。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶回收后，测序得到DNA的序列信息。
1.3 生物信息学分析 对测序结果进行分析，推导编码蛋白质的氨基酸序列，以编码蛋白质的氨基酸序列对GenBank中的非冗余蛋白质数据库进行Blastp分析，使用DNAstar进行对序列比对。
1.4 灯盏花不同部位CHS的荧光定量测定 分别采用灯盏花的根、茎、叶、花4个部位为材料，提取其总RNA、反转录成cDNA。采用ABI PRISM 7900HT qRT-PCR检测系统，按照反应试剂盒为SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，DRR041A)说明书配置PCR反应体系：SYBR混合物5 μL，引物F(10 μmol·L-1) 0.3 μL，引物R(10 μmol·L-1) 0.3 μL，cDNA模板(反转后稀释5倍)2.5 μL，加灭菌双蒸水1.9 μL至反应体系10 μL。设置反应程序：采用二步法，分别为PCR反应条件：酶激活95 ℃ 30 s；循环(95 ℃ 5 s，61 ℃ 30 s)，共进行40个循环。, 百拇医药(刘涛 牟兰 梁艳丽 王建军 杨生超)
方法：通过RT-PCR及RACE方法从灯盏花中克隆CHS基因全长，利用荧光定量PCR方法检测该基因在灯盏花各组织中的表达量，采用HPLC分析各组织中灯盏乙素的含量。
结果：序列全长1 270 bp，编码405氨基酸，该基因DNA序列与菊科植物的同源基因相似性在80%左右，荧光定量显示CHS在叶中表达量最高，远高于根、茎和花；HPLC发现灯盏乙素在叶中含量最高，其次是花和茎，而在根中未检测到。
结论：相关性分析表明CHS相对表达量与灯盏花不同部位灯盏乙素含量间呈正相关关系(r=0.761，P<0.05)，说明灯盏乙素的生成与CHS基因的表达密切相关。
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[关键词]灯盏花；灯盏乙素；查尔酮合成酶灯盏花Erigeron breviscapus (Vant.) Hand.-Mazz.是为菊科飞蓬属多年生草本植物[1]，具有散寒解表、祛风除湿、活血化瘀、通经活络、消炎止痛的功效。灯盏乙素是灯盏花的主要药用成分[2]， 是类黄酮代谢途径中前面几步的代谢产物。
现已知植物中查尔酮合酶是类黄酮途径的第一个关键酶，它可以催化1分子4-香豆酰-CoA与3分子丙二酰-CoA缩合形成柚苷配基查尔酮。柚苷配基查尔酮是花青苷类色素和植物黄酮类物质合成的前体[3] ，CHS是植物黄酮、异黄酮类物质合成的限速酶，该酶的表达受UV照射[4]、真菌侵染等条件诱导[5]。目前，GenBank注册的与CHS有关的核酸序列已经有5 000多条，涉及到的植物主要是豆科的大豆Glycine max、苜蓿Medicago sativa、豌豆Pisum sativum；十字花科的拟南芥Arabidopsis thaliana；禾本科的水稻Oryza sativa、玉米Zea mays；葡萄科的葡萄Vitis vinifera等。
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目前灯盏花的人工引种栽培过程中存在繁殖慢，成活率低，尤其是品质不稳定甚至退化等问题，同时由于有效成分灯盏乙素在全药材中的含量很低，在一定程度上也降低了灯盏花药材大面积种植的附加值，增加了投入成本。尽管前人曾报道利用化学合成的方法来合成灯盏乙素[6]，但化学合成存在原料成本高和化学污染等问题，至今未实现工厂化生产。
因此，在充分了解灯盏花中灯盏乙素合成机制的基础上采用基因工程的方法生产灯盏乙素将是未来发展的一个重要方向。到目前为止，灯盏花中查尔酮合成酶(CHS)基因已被成功克隆[7]，但关于它的基因表达量与灯盏乙素含量关系的研究至今仍未报道。
本研究拟以灯盏花为材料，克隆灯盏花CHS基因，利用荧光定量技术探讨不同部位CHS表达量，同时利用HPLC方法检测不同部位的灯盏乙素含量，采用相关性分析探讨CHS基因表达与灯盏乙素合成之间的关系，为研究灯盏乙素生物合成的分子过程及调控机制奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 供试材料与cDNA的合成 采集灯盏花新鲜根、茎、叶、花，用于总RNA提取的材料保存于-70 ℃冰箱备用；用于高效液相实验的根、茎、叶、花于40 ℃的干燥箱，待烘干后用粉碎机打粉成100目备用。采用Plant RNA Isolation Kid (Promega) 提取灯盏花的根、茎、叶、花的总RNA。cDNA合成方法参照Promega 公司提供的Reverse Transcription System操作手册进行。
1.2 引物设计与CHS cDNA全序列的获得 根据GenBank中下载的CHS基因序列采用Primer 5.0 软件设计。序列为F：5′-GCGATAACACAAGTCCTTCC-3′；R：5′-ATGATACTGGCAGGGTGGT-3′；配制PCR反应体系：cDNA(1∶10) 2 μL，10×PCR buffer 5 μL，10 mmol·L-1dNTP mix 1 μL，引物各1.5 μL，rTaq酶加入0.5 μL，用ddH2O补足至50 μL。PCR扩增反应程序如下：94 ℃变性3 min；94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后送至天跟生化科技公司测序。
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5′RACE以CHS核心基因片段为模板，Primer 5.0设计5′RACE反应引物，5CHS：5′-GGTGCAGAAGATGAGATGAGTGA-3′，按照BD SMARTM RACE cDNA amplification kit操作。5′RACE的PCR条件：94 ℃ 30 s；68 ℃ 30 s；72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 8 min， 1个循环；4 ℃终止。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶回收后，测序得到DNA的序列信息。
1.3 生物信息学分析 对测序结果进行分析，推导编码蛋白质的氨基酸序列，以编码蛋白质的氨基酸序列对GenBank中的非冗余蛋白质数据库进行Blastp分析，使用DNAstar进行对序列比对。
1.4 灯盏花不同部位CHS的荧光定量测定 分别采用灯盏花的根、茎、叶、花4个部位为材料，提取其总RNA、反转录成cDNA。采用ABI PRISM 7900HT qRT-PCR检测系统，按照反应试剂盒为SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，DRR041A)说明书配置PCR反应体系：SYBR混合物5 μL，引物F(10 μmol·L-1) 0.3 μL，引物R(10 μmol·L-1) 0.3 μL，cDNA模板(反转后稀释5倍)2.5 μL，加灭菌双蒸水1.9 μL至反应体系10 μL。设置反应程序：采用二步法，分别为PCR反应条件：酶激活95 ℃ 30 s；循环(95 ℃ 5 s，61 ℃ 30 s)，共进行40个循环。, 百拇医药(刘涛 牟兰 梁艳丽 王建军 杨生超)