白脉散有效成分组调控神经干细胞增殖的实验研究(1)
[摘要] 神经干细胞(NSCs)具有替代及修复受损神经组织的作用，研究发现能够通过调控NSCs内环境诱导其增殖分化，重塑神经功能，从而修复脑卒中神经病变等神经系统损伤。本实验研究了蒙药白脉散有效成分组(BMECG)激活NSCs增殖的药理学作用。通过建立体内外2种损伤模型，模拟脑卒中神经病变，分别利用流式细胞术、行为学检测、Nestin免疫组化等方法研究BMECG的脑保护作用机制。结果表明，BMECG能够显著提高体外培养NSCs增殖能力，有助于小鼠的行为学功能恢复，明显改善模型小鼠大脑皮层NSCs增殖能力。因此BMECG直接针对NSCs增殖存活能力发挥作用，可能是治疗脑卒中神经病变的机制之一，该药物具有重要的研究意义和广阔的应用前景。
[关键词] 白脉散；有效成分组；神经干细胞；脑卒中；羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色法
[收稿日期] 2013-04-18
[基金项目] 国家自然科学基金面上项目(81173657)
, 百拇医药
[通信作者] *陈小玉，E-mail：xiaoyu0767@163、com
[作者简介] 刘庆山，Tel/Fax：(010)68933254，E-mail： nlqsh@163、com “有效成分组”是指复方中与治疗目的密切相关的活性成分的总和，是传统复方现代化的重要指导理论之一[1]。白脉散有效成分组(Baimai effective compounds group， BMECG)是课题组在“复方有效成分组”理论指导下从蒙药经典方剂白脉散中获得的“组分中药”，由人参皂苷Rg1、胡黄连苷II、牛磺酸等组成，成分清楚，质量可控[2-3]。白脉散源自《四部医典》，临床可用于治疗白脉病等病症[4]，为发挥民族药大复方多组分、多靶点的特点，对其有效成分进行深入研究，研究BMECG对脑卒中神经病变的作用和机制，本研究采用体外实验及整体实验，对BMECG影响NSCs的作用进行了研究。
1 材料
, 百拇医药 1、1 动物
一日龄Wistar大鼠，SPF级，购自北京维通利华有限公司，许可证号SCXK(京)2006-0008；健康雄性昆明小鼠，SPF级，体重(20±2) g，购自北京维通利华有限公司，许可证号SCXK(京)2009-0017。
1、2 药品
人参皂苷Rg1(纯度98%，昆明双星科技开发有限公司)，胡黄连苷Ⅱ(纯度90%，南京景竹生物科技公司)，白脉散有效成分组为本实验室自制，由人参皂苷Rg1、没食子酸、胡黄连苷II、牛磺酸等成分按照质量百分比33%，30%，33%，4%组成。
1、3 试剂
胎牛血清(澳大利亚进口，浙江天航生物科技有限公司分装)；DMEM/F12培养基、神经干细胞培养添加剂B27 (Gibco公司)；重组牛碱性成纤维生长因子bFGF (珠海亿胜生物制药有限公司)；MAP-2兔抗鼠一抗、Nestin兔抗鼠一抗(Sigma公司)；CFDA-SE试剂盒(碧云天生物技术研究所)；FITC标记山羊抗兔二抗(北京中衫金桥生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒、Mayor苏木素(武汉博士德生物工程有限公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (碧云天生物技术研究所)；其余试剂均为市售分析纯。
, 百拇医药
1、4 仪器
ZB-200平衡转棒仪(成都泰盟软件有限公司)；超净工作台(北京医疗设备厂)；CB150二氧化碳培养箱(德国Binder)；HERAcell 150三气培养箱(美国Thermo公司)；流式细胞仪(FACSCalibur， BD公司，美国)；IX81自动型倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；5804R型低速冷冻离心机(德国艾本德公司)。
2 方法
2、1 体外NSCs氧糖剥夺/复供增殖模型的制备
2、1、1 原代培养大鼠NSCs 取一日龄新生大鼠，以75%乙醇浸泡灭菌，置于无菌工作台中冰上操作。取出大脑皮层置于4 ℃PBS中，剥离血管和脑膜后置于小西林瓶中加2 mL培养基剪成泥状，用吹打法分散细胞，200目钢筛过滤。1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入 DMEM/F12完全培养基(含bFGF 50 μg·L-1，2%B27)，吹打成细胞悬液。0、4%台盼蓝计数，调整细胞密度，按5×105个/mL接种于25 cm2细胞培养瓶中。置于37 ℃，5%CO2培养箱中悬浮培养，待NSCs形成克隆球后适时传代[5]。首先利用NSCs特异性表面标记物巢蛋白(Nestin)按常规免疫荧光实验方法进行鉴定。给药后每天选取6个不同视野，在倒置显微镜下拍照，最后应用Image-Pro-Plus 6、0软件进行处理，观察克隆球数目变化及直径计算其增殖能力。
, 百拇医药
培养3～4 d后，培养基中可见桑葚样的细胞克隆聚集物，直径多为70 μm左右，折光性强，细胞边界清楚。培养至第5天，克隆球的数量、直径均有明显增加，由数百个细胞组成，形态较规则，平均直径约为100 μm。常规培养至第7天，可见大量NSCs典型的克隆球形成，直径增加至126 μm左右，呈球形悬浮生长。传代3次后经免疫荧光染色显示各克隆球内细胞呈Nestin强阳性，无神经元和神经胶质细胞NSE和GFAP的特异性荧光表现(图1)。结果显示所培养的NSCs具有显著的自我更新增殖能力，且表达干细胞特性。
A、大鼠神经干细胞常规培养第7天(×200)；B、第3代传代克隆球(×400)；C、神经干细胞克隆球Nestin染色(免疫荧光染色，×400)。
图1 体外培养大鼠神经干细胞
Fig、1 Primary cultured rat neural stem cells
NSCs诱导分化24 h后可见绝大多数NSCs贴壁生长。第7天可见细胞均匀分布于孔板中，单层生长，呈现神经元样或胶质细胞样形态。免疫荧光染色后显示MAP-2阳性可见，也就表明所培养的NSCs具有分化为神经元的能力(图2)。综上所述，本实验体外培养大鼠NSCs显示神经干细胞特异性标记物，且具有自我更新能力及分化为神经元的潜能，可用于药物实验研究。, http://www.100md.com(刘庆山 陈小玉 庄述娟 李克琴)
[关键词] 白脉散；有效成分组；神经干细胞；脑卒中；羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色法
[收稿日期] 2013-04-18
[基金项目] 国家自然科学基金面上项目(81173657)
, 百拇医药
[通信作者] *陈小玉，E-mail：xiaoyu0767@163、com
[作者简介] 刘庆山，Tel/Fax：(010)68933254，E-mail： nlqsh@163、com “有效成分组”是指复方中与治疗目的密切相关的活性成分的总和，是传统复方现代化的重要指导理论之一[1]。白脉散有效成分组(Baimai effective compounds group， BMECG)是课题组在“复方有效成分组”理论指导下从蒙药经典方剂白脉散中获得的“组分中药”，由人参皂苷Rg1、胡黄连苷II、牛磺酸等组成，成分清楚，质量可控[2-3]。白脉散源自《四部医典》，临床可用于治疗白脉病等病症[4]，为发挥民族药大复方多组分、多靶点的特点，对其有效成分进行深入研究，研究BMECG对脑卒中神经病变的作用和机制，本研究采用体外实验及整体实验，对BMECG影响NSCs的作用进行了研究。
1 材料
, 百拇医药 1、1 动物
一日龄Wistar大鼠，SPF级，购自北京维通利华有限公司，许可证号SCXK(京)2006-0008；健康雄性昆明小鼠，SPF级，体重(20±2) g，购自北京维通利华有限公司，许可证号SCXK(京)2009-0017。
1、2 药品
人参皂苷Rg1(纯度98%，昆明双星科技开发有限公司)，胡黄连苷Ⅱ(纯度90%，南京景竹生物科技公司)，白脉散有效成分组为本实验室自制，由人参皂苷Rg1、没食子酸、胡黄连苷II、牛磺酸等成分按照质量百分比33%，30%，33%，4%组成。
1、3 试剂
胎牛血清(澳大利亚进口，浙江天航生物科技有限公司分装)；DMEM/F12培养基、神经干细胞培养添加剂B27 (Gibco公司)；重组牛碱性成纤维生长因子bFGF (珠海亿胜生物制药有限公司)；MAP-2兔抗鼠一抗、Nestin兔抗鼠一抗(Sigma公司)；CFDA-SE试剂盒(碧云天生物技术研究所)；FITC标记山羊抗兔二抗(北京中衫金桥生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒、Mayor苏木素(武汉博士德生物工程有限公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (碧云天生物技术研究所)；其余试剂均为市售分析纯。
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1、4 仪器
ZB-200平衡转棒仪(成都泰盟软件有限公司)；超净工作台(北京医疗设备厂)；CB150二氧化碳培养箱(德国Binder)；HERAcell 150三气培养箱(美国Thermo公司)；流式细胞仪(FACSCalibur， BD公司，美国)；IX81自动型倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；5804R型低速冷冻离心机(德国艾本德公司)。
2 方法
2、1 体外NSCs氧糖剥夺/复供增殖模型的制备
2、1、1 原代培养大鼠NSCs 取一日龄新生大鼠，以75%乙醇浸泡灭菌，置于无菌工作台中冰上操作。取出大脑皮层置于4 ℃PBS中，剥离血管和脑膜后置于小西林瓶中加2 mL培养基剪成泥状，用吹打法分散细胞，200目钢筛过滤。1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入 DMEM/F12完全培养基(含bFGF 50 μg·L-1，2%B27)，吹打成细胞悬液。0、4%台盼蓝计数，调整细胞密度，按5×105个/mL接种于25 cm2细胞培养瓶中。置于37 ℃，5%CO2培养箱中悬浮培养，待NSCs形成克隆球后适时传代[5]。首先利用NSCs特异性表面标记物巢蛋白(Nestin)按常规免疫荧光实验方法进行鉴定。给药后每天选取6个不同视野，在倒置显微镜下拍照，最后应用Image-Pro-Plus 6、0软件进行处理，观察克隆球数目变化及直径计算其增殖能力。
, 百拇医药
培养3～4 d后，培养基中可见桑葚样的细胞克隆聚集物，直径多为70 μm左右，折光性强，细胞边界清楚。培养至第5天，克隆球的数量、直径均有明显增加，由数百个细胞组成，形态较规则，平均直径约为100 μm。常规培养至第7天，可见大量NSCs典型的克隆球形成，直径增加至126 μm左右，呈球形悬浮生长。传代3次后经免疫荧光染色显示各克隆球内细胞呈Nestin强阳性，无神经元和神经胶质细胞NSE和GFAP的特异性荧光表现(图1)。结果显示所培养的NSCs具有显著的自我更新增殖能力，且表达干细胞特性。
A、大鼠神经干细胞常规培养第7天(×200)；B、第3代传代克隆球(×400)；C、神经干细胞克隆球Nestin染色(免疫荧光染色，×400)。
图1 体外培养大鼠神经干细胞
Fig、1 Primary cultured rat neural stem cells
NSCs诱导分化24 h后可见绝大多数NSCs贴壁生长。第7天可见细胞均匀分布于孔板中，单层生长，呈现神经元样或胶质细胞样形态。免疫荧光染色后显示MAP-2阳性可见，也就表明所培养的NSCs具有分化为神经元的能力(图2)。综上所述，本实验体外培养大鼠NSCs显示神经干细胞特异性标记物，且具有自我更新能力及分化为神经元的潜能，可用于药物实验研究。, http://www.100md.com(刘庆山 陈小玉 庄述娟 李克琴)