雷公藤多苷调节肾组织p38MAPK信号通路改善糖尿病肾病肾小球炎症性损伤的作用和机制(1)
[摘要] 目的：探讨雷公藤多苷(multi-glycoside of Tripterygium wilfordii，GTW)在体内改善糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)模型鼠肾小球炎症性损伤的作用和机制。方法：采用单侧肾切除联合腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立DN模型。将大鼠随机分为3组：假手术组、对照组、GTW组，各5只。大鼠在造模成功后分别经灌胃给予蒸馏水(2 mL)或GTW悬浊液(50 mg·kg-1·d-1)，每日1次，连续8周。各组大鼠自给药开始计时，第8周末处死。采集血液、尿液样本和肾组织，观察各组大鼠尿白蛋白、肾功能、肾小球形态特征、巨噬细胞(ED1+细胞)浸润以及肾组织肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α，白介素(interleukin，IL)-1β，p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，磷酸化p38MAPK(phosphorylated p38，p-p38MAPK)，转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1的蛋白表达水平。结果：GTW能改善DN模型鼠一般情况、体重，减少尿白蛋白，减轻肾小球硬化，抑制肾小球ED1+细胞浸润，下调肾组织TNF-α，IL-1β，p-p38MAPK，TGF-β1蛋白表达水平。结论：GTW在体内具有抑制炎症细胞浸润和炎症因子表达，减轻肾组织炎症性损伤的作用；GTW通过下调肾组织p38MAPK信号通路中关键信号分子——p-p38MAPK蛋白表达水平，抑制炎症信号通路活性，减少TGF-β1表达，从而，改善肾组织炎症性损伤。
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[关键词] 糖尿病肾病；雷公藤多苷；炎症；p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路
目前，炎症(inflammation)作为糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)糖代谢紊乱、血流动力学障碍、氧化应激损伤等经典发病机制的下游途径被国内外学者高度关注[1]。DN炎症性损伤包括炎症细胞(inflammatory cell)活化、炎症因子(inflammatory cytokine)高表达、炎症信号通路(inflammatory signaling pathway)激活等重要环节。其中，p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路不但可以调控炎症细胞增殖、分化和凋亡过程，而且，在炎症参与的肾组织病变(肾小球硬化和肾间质纤维化)中发挥着关键作用。研究表明，在DN相关病理因素诱导下，肾小球中浸润的巨噬细胞(macrophage，MΦ)活化，过度生成炎症因子，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白介素(interleukin，IL)-1β、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP)-1等，诱导磷酸化p38MAPK(phosphorylated p38，p-p38MAPK)高表达，从而，激活p38MAPK信号通路，促进下游产物——转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1基因转录和蛋白表达，导致系膜细胞(mesangial cell，MC)增生及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积，最终，形成肾小球硬化[2]。因此，国内外学者认为，炎症是促进DN肾小球硬化的恶化因素；改善炎症，尤其是抑制p38MAPK信号通路的活性，就可以改善DN肾小球炎症性损伤[3-4]。
, 百拇医药
近年来，经典的抗炎症单味中药——雷公藤多苷(multi-glycoside of Tripterygium wilfordii，GTW)在临床上被应用于治疗DN蛋白尿。据报道[5]，GTW(120 mg·d-1)治疗65例DN患者3个月，蛋白尿减少，肾功能改善，其疗效优于缬沙坦；GTW治疗DN患者8周，其保护足细胞的作用与厄贝沙坦相当。此外，GTW可以减少DN模型鼠蛋白尿，改善肾小球硬化性损伤，其作用类似贝那普利[6]。然而，迄今为止，针对DN模型相关的肾小球炎症性损伤，GTW在体内的作用和机制还不是很清楚。因此，笔者借助单侧肾切除联合链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的DN模型，阐明GTW在体内改善DN肾小球炎症性损伤的作用和机制。
1 材料
1.1 动物 15只8周龄左右的雄性Sprague Dawley大鼠(SPF)购自南京军区总院动物中心(批号slxk2012-02)，饲养于南京大学医学院附属鼓楼医院(简称“鼓楼医院”)动物实验中心。
, 百拇医药
1.2 药物和试剂 STZ购自Sigma公司，GTW购自江苏泰州美通制药有限公司(批号090513)。据报道[7]，对于抗Thy1.1抗体诱导的慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)模型鼠而言，GTW有效而安全的剂量为50 mg·kg-1·d-1；将GTW 10 g溶解于10 mL蒸馏水中，配置GTW悬浊液(1 g·mL-1)。全蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchonininc acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自凯基公司，山羊抗小鼠IgG抗体购自联科公司，驴抗兔Alexa Fluor 594购自Invitrogen公司，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体、小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)单克隆抗体、小鼠抗大鼠TNF-α单克隆抗体、小鼠抗大鼠巨噬细胞(ED1+细胞)单克隆抗体购自Abcam公司，兔抗大鼠p38MAPK和p-p38MAPK多克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司，兔抗大鼠IL-1β多克隆抗体、兔抗大鼠β-actin多克隆抗体、小鼠抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate deydrogensae，GAPDH)单克隆抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG购自Bioworld公司。, 百拇医药(黄燕如 万毅刚 孙伟 毛志敏 赵青 史喜苗 姚建)
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[关键词] 糖尿病肾病；雷公藤多苷；炎症；p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路
目前，炎症(inflammation)作为糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)糖代谢紊乱、血流动力学障碍、氧化应激损伤等经典发病机制的下游途径被国内外学者高度关注[1]。DN炎症性损伤包括炎症细胞(inflammatory cell)活化、炎症因子(inflammatory cytokine)高表达、炎症信号通路(inflammatory signaling pathway)激活等重要环节。其中，p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路不但可以调控炎症细胞增殖、分化和凋亡过程，而且，在炎症参与的肾组织病变(肾小球硬化和肾间质纤维化)中发挥着关键作用。研究表明，在DN相关病理因素诱导下，肾小球中浸润的巨噬细胞(macrophage，MΦ)活化，过度生成炎症因子，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白介素(interleukin，IL)-1β、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP)-1等，诱导磷酸化p38MAPK(phosphorylated p38，p-p38MAPK)高表达，从而，激活p38MAPK信号通路，促进下游产物——转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1基因转录和蛋白表达，导致系膜细胞(mesangial cell，MC)增生及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积，最终，形成肾小球硬化[2]。因此，国内外学者认为，炎症是促进DN肾小球硬化的恶化因素；改善炎症，尤其是抑制p38MAPK信号通路的活性，就可以改善DN肾小球炎症性损伤[3-4]。
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近年来，经典的抗炎症单味中药——雷公藤多苷(multi-glycoside of Tripterygium wilfordii，GTW)在临床上被应用于治疗DN蛋白尿。据报道[5]，GTW(120 mg·d-1)治疗65例DN患者3个月，蛋白尿减少，肾功能改善，其疗效优于缬沙坦；GTW治疗DN患者8周，其保护足细胞的作用与厄贝沙坦相当。此外，GTW可以减少DN模型鼠蛋白尿，改善肾小球硬化性损伤，其作用类似贝那普利[6]。然而，迄今为止，针对DN模型相关的肾小球炎症性损伤，GTW在体内的作用和机制还不是很清楚。因此，笔者借助单侧肾切除联合链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的DN模型，阐明GTW在体内改善DN肾小球炎症性损伤的作用和机制。
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1.1 动物 15只8周龄左右的雄性Sprague Dawley大鼠(SPF)购自南京军区总院动物中心(批号slxk2012-02)，饲养于南京大学医学院附属鼓楼医院(简称“鼓楼医院”)动物实验中心。
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1.2 药物和试剂 STZ购自Sigma公司，GTW购自江苏泰州美通制药有限公司(批号090513)。据报道[7]，对于抗Thy1.1抗体诱导的慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)模型鼠而言，GTW有效而安全的剂量为50 mg·kg-1·d-1；将GTW 10 g溶解于10 mL蒸馏水中，配置GTW悬浊液(1 g·mL-1)。全蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchonininc acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自凯基公司，山羊抗小鼠IgG抗体购自联科公司，驴抗兔Alexa Fluor 594购自Invitrogen公司，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体、小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)单克隆抗体、小鼠抗大鼠TNF-α单克隆抗体、小鼠抗大鼠巨噬细胞(ED1+细胞)单克隆抗体购自Abcam公司，兔抗大鼠p38MAPK和p-p38MAPK多克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司，兔抗大鼠IL-1β多克隆抗体、兔抗大鼠β-actin多克隆抗体、小鼠抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate deydrogensae，GAPDH)单克隆抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG购自Bioworld公司。, 百拇医药(黄燕如 万毅刚 孙伟 毛志敏 赵青 史喜苗 姚建)