子宫内膜异位症病灶神经纤维分布的研究(1)
【摘 要】目的：探讨子宫内膜异位症病灶中神经纤维分布的特点及与疼痛的相关性。方法：用免疫组化法检测不同内异症组织中有髓和无髓神经纤维的分布，分析不同内异症病灶神经数目的差异及这种差异性和疼痛症状及临床分期的相关性。结果：内异症腹膜和宫骶韧带病灶中无髓神经纤维数目高于正常腹膜(P<0.05)和正常宫骶韧带组织(P<0.05)。卵巢内膜异位症囊肿壁中神经纤维无表达或仅少量表达。不同内异症组织中无髓神经纤维数目有明显差异：宫骶韧带内异症组织中无髓纤维数目明显高于腹膜内异症及卵巢内异症病灶。有髓神经纤维数目各组间比较无显著差异。不同内异症组织中无髓神经纤维数目与临床分期无相关性。结论：内异症组织中无髓神经纤维数目增加，并且不同内异症组织中无髓神经纤维的数目有显著差异，这种差异与盆腔疼痛有不同程度的相关性，而与临床分期无关，从神经解剖学机制方面解释了内异症疼痛为何与盆腔病灶分布密切相关的问题。
【关键词】子宫内膜异位症；蛋白基因产物9.5；神经丝蛋白；VAS疼痛评分
, http://www.100md.com 【中图分类号】R711.71 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2012)09-0006-02
子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)病灶分布广泛，可累及盆腔内多个脏器，引起不同的临床症状，其中疼痛是子宫内膜异位症最重要的临床症状。而目前常规的内异症治疗方法对疼痛的缓解率较低，并且停药后易复发，原因在于对内异症的发生机制尚不明确。神经解剖学的改变是导致疼痛的重要机制，近年已有国外学者将这种神经解剖学的改变应用于子宫内膜异位症疼痛的发生机制的研究中， 2005年Karen JB[1]在SCIENCE杂志撰文认为内异症疼痛的机制之一就是异位内膜病灶中神经纤维支配的形成。虽然国外对神经纤维与EMs相关疼痛的关系已进行了一定的研究但是分组缺乏神经纤维分布在不同类型EMs病灶、不同疼痛程度、不同疼痛类型、不同临床分期患者之间的比较。我们通过测定不同类型的EMs病灶(腹膜子宫内膜异位症、卵巢子宫内膜异位症囊肿、宫骶韧带子宫内膜异位症结节)中蛋白基因产物9.5(protein Gene Product,PGP9.5)及神经丝蛋白(neurofilament,NF)标记的神经纤维的表达，并探讨其与临床疼痛症状的关系。
, 百拇医药
1材料和方法
1.1研究对象：
选取2010年10月～2012年1月在佛山保健院妇科住院通过腹腔镜手术治疗EMs的患者共122例作为研究组,研究组患者年龄23-41岁(平均年龄32.12岁)，详细记录患者术前痛经的视觉模拟评分(VAS)；腹腔镜手术分期(根据rAFS标准)；病灶分布部位以及患者的一般情况。腹腔镜手术中由有经验的妇科医生取腹膜内异症病灶(peritoneal endomeriosis PEM)41例，卵巢内异症囊肿壁(ovarian endometriosis OEM)46例，宫骶韧带内异症结节(uterosacral ligment endometriosis USL-EM)35例。对照组为腹腔镜手术治疗的卵巢成熟性畸胎瘤或子宫平滑肌瘤患者61例，患者年龄20-45岁(平均年龄33.61岁)，无痛经、慢性盆腔痛、性交痛、肛门坠胀感患者，腹腔镜术中由有经验妇科医生取外观形态正常腹膜组织(peritoneum of control PC)20例、卵巢成熟性畸胎瘤囊壁(mature teratoma Mt)23例、子宫切除术患者的宮骶韧带组织(uterosacral ligment of control USL-C)18例。实验组和对照组年龄无显著差异(P>0.05)。
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1.2方法
1.2.1疼痛评分
实验组患者采用视觉模拟(VAS)评分方法对痛经、肛门坠痛、性交痛以及慢性盆腔痛(chronic pelvic pain CPP)进行疼痛评分。VAS评分标准是从无疼痛到剧烈疼痛分为10级，无痛0分，剧烈疼痛10分。采用统一的VAS评分卡由患者指出自己的疼痛评分。
1.2.2免疫组化法测定在位子宫内膜功能层PGP9.5、NF
1.2.2.1试剂
鼠抗人蛋白基因产物9.5(PGP 9.5)单克隆抗体：北京中杉树金桥生物技术有限公司。鼠抗人神经丝蛋白(NF-L+H)：福州迈新生物技术开发公司。
1.2.2.2步骤
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标本取出后立即置入10%甲醛中浸泡18—24小时固定，常规石蜡包埋。以人小肠和脑组织切片为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照，每例组织石蜡切片3张，1张HE染色核实病理诊断，余2张行免疫组化染色。切片厚4μm，石蜡切片常规脱蜡浸水，蒸馏水浸泡5min；PBS冲洗3次；枸橼酸缓冲液煮沸(沸水浴)修复15分钟；PBS冲洗3次；3%过氧化氢溶液，室温孕育20min；PBS冲洗3次；滴加正常山羊血清工作液，37℃孵育15min，后去除多余正常山羊血清工作液；滴加一抗蛋白基因产物9.5单克隆抗体、鼠抗人神经丝蛋白。复温20min，PBS冲洗3次；二抗孵育，37℃20min，室温孵育20min；PBS冲洗3次；三抗(辣根酶标记链酶卵白素工作液)孵育，37℃20min ；PBS冲洗3次；DAB显色；自来水充分冲洗，脱水透明、封片。
1.2.3结果判定
神经纤维计数：先在低倍镜下(×100)选取高神经纤维密度区，再转换成高倍(×400)，每高倍视野下有一面积为1mm2的正方形网格，共计数5个网格中神经纤维的数量(非随机选择视野)，取平均值作为石蜡切片的神经纤维密度。神经纤维密度的结果采用中位数(范围)表示。
1.3统计分析
采用SPSS16.0软件进行统计学分析。检测结果以均数±标准差(χ±s)表示。P<0.05认为差异有显著性意义。各组神经纤维密度为偏态分布，采用非参数秩和检验(Mann-Whiteney U 检验及Kruskal-Wallis 检验)；各组神经纤维数目的差异与疼痛的关系采用Spearman等级相关分析；多个样本均数的比较用随机区组的两因素方差分析。, http://www.100md.com(袁惠芝 柳晓春 王夷黎 张汝坚 陈永连)
【关键词】子宫内膜异位症；蛋白基因产物9.5；神经丝蛋白；VAS疼痛评分
, http://www.100md.com 【中图分类号】R711.71 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2012)09-0006-02
子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)病灶分布广泛，可累及盆腔内多个脏器，引起不同的临床症状，其中疼痛是子宫内膜异位症最重要的临床症状。而目前常规的内异症治疗方法对疼痛的缓解率较低，并且停药后易复发，原因在于对内异症的发生机制尚不明确。神经解剖学的改变是导致疼痛的重要机制，近年已有国外学者将这种神经解剖学的改变应用于子宫内膜异位症疼痛的发生机制的研究中， 2005年Karen JB[1]在SCIENCE杂志撰文认为内异症疼痛的机制之一就是异位内膜病灶中神经纤维支配的形成。虽然国外对神经纤维与EMs相关疼痛的关系已进行了一定的研究但是分组缺乏神经纤维分布在不同类型EMs病灶、不同疼痛程度、不同疼痛类型、不同临床分期患者之间的比较。我们通过测定不同类型的EMs病灶(腹膜子宫内膜异位症、卵巢子宫内膜异位症囊肿、宫骶韧带子宫内膜异位症结节)中蛋白基因产物9.5(protein Gene Product,PGP9.5)及神经丝蛋白(neurofilament,NF)标记的神经纤维的表达，并探讨其与临床疼痛症状的关系。
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1材料和方法
1.1研究对象：
选取2010年10月～2012年1月在佛山保健院妇科住院通过腹腔镜手术治疗EMs的患者共122例作为研究组,研究组患者年龄23-41岁(平均年龄32.12岁)，详细记录患者术前痛经的视觉模拟评分(VAS)；腹腔镜手术分期(根据rAFS标准)；病灶分布部位以及患者的一般情况。腹腔镜手术中由有经验的妇科医生取腹膜内异症病灶(peritoneal endomeriosis PEM)41例，卵巢内异症囊肿壁(ovarian endometriosis OEM)46例，宫骶韧带内异症结节(uterosacral ligment endometriosis USL-EM)35例。对照组为腹腔镜手术治疗的卵巢成熟性畸胎瘤或子宫平滑肌瘤患者61例，患者年龄20-45岁(平均年龄33.61岁)，无痛经、慢性盆腔痛、性交痛、肛门坠胀感患者，腹腔镜术中由有经验妇科医生取外观形态正常腹膜组织(peritoneum of control PC)20例、卵巢成熟性畸胎瘤囊壁(mature teratoma Mt)23例、子宫切除术患者的宮骶韧带组织(uterosacral ligment of control USL-C)18例。实验组和对照组年龄无显著差异(P>0.05)。
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1.2方法
1.2.1疼痛评分
实验组患者采用视觉模拟(VAS)评分方法对痛经、肛门坠痛、性交痛以及慢性盆腔痛(chronic pelvic pain CPP)进行疼痛评分。VAS评分标准是从无疼痛到剧烈疼痛分为10级，无痛0分，剧烈疼痛10分。采用统一的VAS评分卡由患者指出自己的疼痛评分。
1.2.2免疫组化法测定在位子宫内膜功能层PGP9.5、NF
1.2.2.1试剂
鼠抗人蛋白基因产物9.5(PGP 9.5)单克隆抗体：北京中杉树金桥生物技术有限公司。鼠抗人神经丝蛋白(NF-L+H)：福州迈新生物技术开发公司。
1.2.2.2步骤
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标本取出后立即置入10%甲醛中浸泡18—24小时固定，常规石蜡包埋。以人小肠和脑组织切片为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照，每例组织石蜡切片3张，1张HE染色核实病理诊断，余2张行免疫组化染色。切片厚4μm，石蜡切片常规脱蜡浸水，蒸馏水浸泡5min；PBS冲洗3次；枸橼酸缓冲液煮沸(沸水浴)修复15分钟；PBS冲洗3次；3%过氧化氢溶液，室温孕育20min；PBS冲洗3次；滴加正常山羊血清工作液，37℃孵育15min，后去除多余正常山羊血清工作液；滴加一抗蛋白基因产物9.5单克隆抗体、鼠抗人神经丝蛋白。复温20min，PBS冲洗3次；二抗孵育，37℃20min，室温孵育20min；PBS冲洗3次；三抗(辣根酶标记链酶卵白素工作液)孵育，37℃20min ；PBS冲洗3次；DAB显色；自来水充分冲洗，脱水透明、封片。
1.2.3结果判定
神经纤维计数：先在低倍镜下(×100)选取高神经纤维密度区，再转换成高倍(×400)，每高倍视野下有一面积为1mm2的正方形网格，共计数5个网格中神经纤维的数量(非随机选择视野)，取平均值作为石蜡切片的神经纤维密度。神经纤维密度的结果采用中位数(范围)表示。
1.3统计分析
采用SPSS16.0软件进行统计学分析。检测结果以均数±标准差(χ±s)表示。P<0.05认为差异有显著性意义。各组神经纤维密度为偏态分布，采用非参数秩和检验(Mann-Whiteney U 检验及Kruskal-Wallis 检验)；各组神经纤维数目的差异与疼痛的关系采用Spearman等级相关分析；多个样本均数的比较用随机区组的两因素方差分析。, http://www.100md.com(袁惠芝 柳晓春 王夷黎 张汝坚 陈永连)
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