机械牵张力加载时间对诱导正常皮肤成纤维细胞向增生性瘢痕成纤维细胞转化过程的影响研究(2)
1 材料和方法
1.1 主要试剂及仪器：MEM Eagle培养基(CORNING公司，美国)、FBS、含EDTA的胰酶(Gibco公司，美国)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(同仁化学，日本)；TGF-β1、Ⅰ型胶原ELISA试剂盒(R&D Systems公司，美国)；TRIzol试剂(Ambion公司，美国)；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；Ⅰ型胶原、TGF-β1 、Integrin-β1、p130Cas、α-SMA及内参GAPDH PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成；p130cas、Integrin-β1、α-SMA兔抗人單克隆抗体(Abcam公司，英国)，山羊抗兔二抗(Abgent公司，苏州)，PVDF膜、ECL发光液(Millipore公司，美国)。
CO2培养箱(Panasonic公司，日本)；倒置显微镜(Olympus公司，日本)；多通道细胞应力加载仪(BF-3001C；Flex-cell公司，美国)；6孔弹性基底膜培养板(BF-3001C；Flex-cell公司，美国)；酶联免疫检测仪(BioTek公司，美国)；ABI ViiA? 7 SYBR Green qPCR仪(ABI公司，美国)；化学发光成像系统(ALPHA FCE公司，美国)。
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1.2 细胞培养与分组：瘢痕组织及正常皮肤部真皮组织均取自接受瘢痕切除植皮术(青岛大学附属医院美容整形外科)的增生性瘢痕患者，共3例，患者本人均知情同意。患者瘢痕均有增生表现，外观呈红色或深红色，质硬，高于周围正常皮肤表面0.5cm以上，术前未进行抗肿瘤类药物、激素类药物或放射性治疗；正常皮肤真皮组织均取自患者正常腹部皮肤，该处皮肤无红肿，无硬结，无色素沉着。男1例，女2例，年龄分别为18、37、41岁。
按照文献应用组织块法体外培养成纤维细胞，取第3～8代细胞进行实验。同一例患者NSFB和HSFB分别设实验组和对照组。调整细胞悬液浓度至1×104个/ml，以2ml/孔均匀接种于6孔弹性基底膜培养板。于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24h，倒置显微镜下观察细胞融合度达30%后，更换培养基。根据前期研究皮肤成纤维细胞对10%拉伸幅度的机械张力产生最明显的机械传导及生化效应[3]，设置加载机械张力参数为拉伸幅度10%，加力频率0.1Hz，加力波形为正弦波。按加力仪说明书要求给予实验组细胞连续加力4h后停止1h，以此循环，每日加力时间不少于10h，加载机械张力的总时间分为3d组、5d组和7d组；加力环境仍为37℃、5%CO2及饱和湿度。对照组不加力，其余培养条件与实验组相同。每组实验重复3次。实验组和对照组细胞每隔2d每孔补充10%血清培养液0.5ml。
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1.3 检测指标
1.3.1 CCK-8法检测细胞增殖：4组分别于各时间点取3孔细胞，每孔加入CCK-8试剂200μl，轻摇培养板将试剂混匀后继续在培养箱中培养3h。分别取200μl细胞培养上清液，置于96孔板中，以不含细胞的培养基作为空白孔，用酶联免疫检测仪在450nm波长处检测吸光度值，以反映细胞数量。
1.3.2 ELISA法检测TGF-β1、Ⅰ型胶原分泌量：收集各组培养板孔细胞上清液，按照TGF-β1、Ⅰ型胶原ELISA试剂盒说明书进行操作，检测TGF-β1、Ⅰ型胶原含量。
1.3.3 SYBR Green qPCR法检测p130Cas、Integrin-β1、TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型胶原的基因表达：各组取3孔细胞，Trizol法提取细胞总RNA，SYBR Green qPCR法检测p130Cas、Integrin-β1、TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达水平。具体操作如下：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10μl、PCR Forward Primer 0.8μl、PCR Reverse Primer 0.8μl、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4μl、灭菌蒸馏水6μl，cDNA溶液2μl，总体系20μl，每样品重复3管；应用ABI ViiA? 7 SYBR Green qPCR仪进行扩增，调整反应条件，以95℃ 30s、95℃ 5s、60℃ 30s重复45个循环。扩增完成后，应用ABI ViiA? 7软件对反应产物的熔解曲线进行自动定量分析。以GAPDH为内参，各引物序列见表1。采用相对定量法计算各目的基因mRNA含量，即根据Ct值计算2-ΔΔct 值。ΔΔCt=(Ct目的-Ct内参)-(Ct对照-Ct内参)。
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1.3.4 Western-Blot法检测Integrin-β1、p130Cas、α-SMA蛋白表达量：各组取3孔细胞，将蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂按100：1的比例制成混合溶液，裂解细胞30min后，提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，测定后加入1/4样品体积量的Loading Buffer，95℃金属浴5min后室温备用。调整电泳参数，浓缩胶80V 30min，分离胶120V、60min。取出凝胶后湿转法转膜，转膜参数280mA 140min。Integrin-β1、p130Cas、α-SMA一抗稀释浓度为1：5 000；内参β-actin稀释浓度1：1 500；二抗稀释浓度1：10 000。一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h后涂ECL发光液于化学发光成像系统中显影。用Image J图像分析系统测定蛋白条带的灰度值，以灰度值和条带面积的乘积(IntDen)进行半定量分析。蛋白相对表达量=实验组(IntDen目的-IntDen内参)/对照组(IntDen目的-IntDen内参)
1.4 统计学分析：采用SPSS 11.5统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用S-N-Ka检验。P<0.05时认为差异有统计学意义。, 百拇医药(朱明宇 李雨珊 王志国)
1.1 主要试剂及仪器：MEM Eagle培养基(CORNING公司，美国)、FBS、含EDTA的胰酶(Gibco公司，美国)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(同仁化学，日本)；TGF-β1、Ⅰ型胶原ELISA试剂盒(R&D Systems公司，美国)；TRIzol试剂(Ambion公司，美国)；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；Ⅰ型胶原、TGF-β1 、Integrin-β1、p130Cas、α-SMA及内参GAPDH PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成；p130cas、Integrin-β1、α-SMA兔抗人單克隆抗体(Abcam公司，英国)，山羊抗兔二抗(Abgent公司，苏州)，PVDF膜、ECL发光液(Millipore公司，美国)。
CO2培养箱(Panasonic公司，日本)；倒置显微镜(Olympus公司，日本)；多通道细胞应力加载仪(BF-3001C；Flex-cell公司，美国)；6孔弹性基底膜培养板(BF-3001C；Flex-cell公司，美国)；酶联免疫检测仪(BioTek公司，美国)；ABI ViiA? 7 SYBR Green qPCR仪(ABI公司，美国)；化学发光成像系统(ALPHA FCE公司，美国)。
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1.2 细胞培养与分组：瘢痕组织及正常皮肤部真皮组织均取自接受瘢痕切除植皮术(青岛大学附属医院美容整形外科)的增生性瘢痕患者，共3例，患者本人均知情同意。患者瘢痕均有增生表现，外观呈红色或深红色，质硬，高于周围正常皮肤表面0.5cm以上，术前未进行抗肿瘤类药物、激素类药物或放射性治疗；正常皮肤真皮组织均取自患者正常腹部皮肤，该处皮肤无红肿，无硬结，无色素沉着。男1例，女2例，年龄分别为18、37、41岁。
按照文献应用组织块法体外培养成纤维细胞，取第3～8代细胞进行实验。同一例患者NSFB和HSFB分别设实验组和对照组。调整细胞悬液浓度至1×104个/ml，以2ml/孔均匀接种于6孔弹性基底膜培养板。于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24h，倒置显微镜下观察细胞融合度达30%后，更换培养基。根据前期研究皮肤成纤维细胞对10%拉伸幅度的机械张力产生最明显的机械传导及生化效应[3]，设置加载机械张力参数为拉伸幅度10%，加力频率0.1Hz，加力波形为正弦波。按加力仪说明书要求给予实验组细胞连续加力4h后停止1h，以此循环，每日加力时间不少于10h，加载机械张力的总时间分为3d组、5d组和7d组；加力环境仍为37℃、5%CO2及饱和湿度。对照组不加力，其余培养条件与实验组相同。每组实验重复3次。实验组和对照组细胞每隔2d每孔补充10%血清培养液0.5ml。
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1.3.1 CCK-8法检测细胞增殖：4组分别于各时间点取3孔细胞，每孔加入CCK-8试剂200μl，轻摇培养板将试剂混匀后继续在培养箱中培养3h。分别取200μl细胞培养上清液，置于96孔板中，以不含细胞的培养基作为空白孔，用酶联免疫检测仪在450nm波长处检测吸光度值，以反映细胞数量。
1.3.2 ELISA法检测TGF-β1、Ⅰ型胶原分泌量：收集各组培养板孔细胞上清液，按照TGF-β1、Ⅰ型胶原ELISA试剂盒说明书进行操作，检测TGF-β1、Ⅰ型胶原含量。
1.3.3 SYBR Green qPCR法检测p130Cas、Integrin-β1、TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型胶原的基因表达：各组取3孔细胞，Trizol法提取细胞总RNA，SYBR Green qPCR法检测p130Cas、Integrin-β1、TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达水平。具体操作如下：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10μl、PCR Forward Primer 0.8μl、PCR Reverse Primer 0.8μl、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4μl、灭菌蒸馏水6μl，cDNA溶液2μl，总体系20μl，每样品重复3管；应用ABI ViiA? 7 SYBR Green qPCR仪进行扩增，调整反应条件，以95℃ 30s、95℃ 5s、60℃ 30s重复45个循环。扩增完成后，应用ABI ViiA? 7软件对反应产物的熔解曲线进行自动定量分析。以GAPDH为内参，各引物序列见表1。采用相对定量法计算各目的基因mRNA含量，即根据Ct值计算2-ΔΔct 值。ΔΔCt=(Ct目的-Ct内参)-(Ct对照-Ct内参)。
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1.3.4 Western-Blot法检测Integrin-β1、p130Cas、α-SMA蛋白表达量：各组取3孔细胞，将蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂按100：1的比例制成混合溶液，裂解细胞30min后，提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，测定后加入1/4样品体积量的Loading Buffer，95℃金属浴5min后室温备用。调整电泳参数，浓缩胶80V 30min，分离胶120V、60min。取出凝胶后湿转法转膜，转膜参数280mA 140min。Integrin-β1、p130Cas、α-SMA一抗稀释浓度为1：5 000；内参β-actin稀释浓度1：1 500；二抗稀释浓度1：10 000。一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h后涂ECL发光液于化学发光成像系统中显影。用Image J图像分析系统测定蛋白条带的灰度值，以灰度值和条带面积的乘积(IntDen)进行半定量分析。蛋白相对表达量=实验组(IntDen目的-IntDen内参)/对照组(IntDen目的-IntDen内参)
1.4 统计学分析：采用SPSS 11.5统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用S-N-Ka检验。P<0.05时认为差异有统计学意义。, 百拇医药(朱明宇 李雨珊 王志国)
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