转化生长因子β1抗体对大鼠肾缺血—再灌注时SMAD7表达的影响(1)
转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1， TGF-β1) 是一类多功能的细胞因子，由多种组织细胞合成，调控着细胞周期，影响细胞的增殖、分化、黏附、转移和凋亡，与人类多种疾病发生发展密切相关[1]。研究表明在大鼠肾缺血-再灌注时TGF-β1表达呈增加趋势[2]。与配体结合后，TGF-β家族受体激活了一个由Smad蛋白家族介导的独特的信号转导通路，Smad7是TGF-β/Smads蛋白信号通路中最重要的内源性抑制因子[3]。笔者采用注射TGF-β1抗体的方法来中和体内表达增多的TGF-β1，观察肾功能损害变化以及此通路上重要抑制因子Smad7的表达变化。
1 材料与方法
1.1 实验材料
健康雄性SD大鼠80只，月龄6个月，体质量220～250 g，一级动物，由温州医学院实验动物中心提供。Smad7抗体、SABC免疫组化试剂盒由武汉博士德生物试剂公司提供，TGF-β1抗体由北京博奥申生物试剂公司提供，DAB显色液北京中杉金桥试剂公司提供。
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1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及方法 雄性SD大鼠80只，随机(随机数字法)分为肾缺血-再灌注损伤模型组(A组)和TGF-β1抗体治疗组(B组)，每组数量40只，组内按再灌注时间不同又分为再灌注0、4、12、24 h 4个小组，每组10只，分别在再灌注到0、4、12、24 h时取材。A组、B组均建立肾缺血-再灌注模型，再灌注达相应时间点时，从各小组大鼠腹主动脉取血2 ml备测血尿素氮(BUN)和血肌酐(Cr)，然后迅速切除左肾，肾组织用10%甲醛固定，制备石蜡切片，作HE染色观察病理变化以及作免疫组化分析肾组织Smad7表达情况(方差分析)。采用全自动生化分析仪、免疫组化、HE染色，分别测定或观察血肌酐、尿素氮、肾组织Smad7表达、肾组织病理改变。
1.2.2 肾缺血-再灌注动物模型制作及标本采集 所有实验动物均术前12 h禁食，自由进水。实验大鼠应用10%的水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定，碘酒酒精消毒手术切口部位，在剑突到耻骨联合之间沿腹白线作一长约6 cm的纵切口开腹，找到双侧肾脏，小心分离右侧肾蒂，左侧肾蒂，用无损伤动脉夹夹闭左右侧肾蒂，阻断出入肾脏血流(在此过程中注意保持实验大鼠体温及减少腹腔的不显性失水)，见肾颜色由红润变为暗红，表明肾血流阻断，45 min后重新恢复肾脏血液灌注，随后B组经腹腔静脉注射TGF-β1抗体(5 mg/kg)，A组经腹腔静脉注射等量的生理盐水。当松开动脉夹后肾脏在2～5 min内颜色由暗红转为鲜红表明缺血-再灌注损伤模型建立成功，肾血管无血栓形成，关腹。若超过5 min肾脏颜色仍然未转为鲜红色则认为肾脏有血栓形成，排除出实验组。实验大鼠麻醉清醒后转入代谢笼内自由进水及进食。再灌注达相应时间点时，从各小组大鼠腹主动脉取血2 ml备测血尿素氮(BUN)和血肌酐(Cr)，然后迅速切除左肾，置于冰盐水中，洗净表面血液，肾组织用 10%甲醛固定，制备石蜡切片。
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1.3 指标检测
1.3.1 肾功能检测 所取血液标本1500 r/min离心30 min，用微量加样器吸取上清，置于EP管中，4 ℃保存于冰箱中。肌酐、尿素氮检测由温州医学院附属二院检验科协助完成。
1.3.2 病理学检验 制备肾组织石蜡切片，经HE染色后，光镜下观察肾组织病理改变。
1.3.3 免疫组织化学分析 石蜡切片经免疫组化处理后，采用Image Plus Pro 6.0软件分析免疫组化结果：视野里棕黄色颗粒视为阳性着色，根据着色深浅程度分级：无着色(阴性)，浅黄色(弱阳性)，棕黄色(阳性)，深棕黄色(强阳性)。
1.4 统计学方法
采用SPSS 12 for Windows软件包对实验数据进行统计学处理。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采取方差分析的方法，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
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2 结果
2.1 肾功能变化
与同一时间点A组比较，0 h组A、B两组血浆BUN差异无统计学意义，其余B组各时间点血浆BUN均显著降低(P<0.05，见表1)；同组内不同时间点间BUN的比较：在A组中，各时间点之间比较差异具有统计学意义(F=98.622，P<0.01)，随再灌注时间的延长，任一时间点均较前时间点BUN明显升高，差异具有统计学意义(均P<0.05)。治疗组中随再灌注时间延长，BUN逐渐升高，各时间点间差异具有统计学意义(F=55.100，P<0.01)。
与同一时间点A组比较，0 h A、B两组血浆Cr差异无统计学意义，其余B组各时间点血浆Cr均显著降低(P<0.05，见表2)；同组内不同时间点间血Cr的比较：在A组中，各时间点之间比较差异具有统计学意义(F=115.205，P<0.01)。其中，随再灌注时间的延长，任一时间点均较前时间点Cr明显升高，差异具有统计学意义(均P<0.05)。B组中随再灌注时间延长，Cr逐渐升高，各时间点间差异具有统计学意义(F=60.119，P<0.01)。
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2.2 肾组织形态改变
假手术组肾小球、肾小管结构完整。肾IR模型组肾脏病理变化明显，多数肾小管上皮细胞肿胀，出现水样变性，部分凝固性坏死、脱落，刷状缘消失，肾小管腔内可见管型，肾间质血管高度扩张充血，可见灶性出血区和灶性炎细胞浸润，但肾小球病变不明显。见图1。
2.3 各组肾组织中Smad7表达情况
在0 h时间点肾脏Smad7阳性表达两组表达差异无统计学意义(P>0.05)。B组肾脏Smad7阳性表达较A组在4、12、24 h均增多(均P<0.05)。A组中，各时间点之间比较差异具有统计学意义(F=134.833，P<0.01)。其中，再灌注0 h组Smad7表达的平均光密度较其他各组明显大，差异具有统计学意义(P<0.01)，24 h组较4、12 h的平均光密度较大(P<0.01)，4 h和12 h组平均光密度差异无统计学意义(P>0.05)；B组在0、4、12 h肾内Smad7的表达随再灌注时间延长也逐渐减少(P<0.01)，再灌注24 h组平均光密度较其余时间点组明显增大，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表3和图2。, 百拇医药(徐俊南 王荣荣 李志涛 王征 龚裕强 孙来芳 陈大庆)
1 材料与方法
1.1 实验材料
健康雄性SD大鼠80只，月龄6个月，体质量220～250 g，一级动物，由温州医学院实验动物中心提供。Smad7抗体、SABC免疫组化试剂盒由武汉博士德生物试剂公司提供，TGF-β1抗体由北京博奥申生物试剂公司提供，DAB显色液北京中杉金桥试剂公司提供。
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1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及方法 雄性SD大鼠80只，随机(随机数字法)分为肾缺血-再灌注损伤模型组(A组)和TGF-β1抗体治疗组(B组)，每组数量40只，组内按再灌注时间不同又分为再灌注0、4、12、24 h 4个小组，每组10只，分别在再灌注到0、4、12、24 h时取材。A组、B组均建立肾缺血-再灌注模型，再灌注达相应时间点时，从各小组大鼠腹主动脉取血2 ml备测血尿素氮(BUN)和血肌酐(Cr)，然后迅速切除左肾，肾组织用10%甲醛固定，制备石蜡切片，作HE染色观察病理变化以及作免疫组化分析肾组织Smad7表达情况(方差分析)。采用全自动生化分析仪、免疫组化、HE染色，分别测定或观察血肌酐、尿素氮、肾组织Smad7表达、肾组织病理改变。
1.2.2 肾缺血-再灌注动物模型制作及标本采集 所有实验动物均术前12 h禁食，自由进水。实验大鼠应用10%的水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定，碘酒酒精消毒手术切口部位，在剑突到耻骨联合之间沿腹白线作一长约6 cm的纵切口开腹，找到双侧肾脏，小心分离右侧肾蒂，左侧肾蒂，用无损伤动脉夹夹闭左右侧肾蒂，阻断出入肾脏血流(在此过程中注意保持实验大鼠体温及减少腹腔的不显性失水)，见肾颜色由红润变为暗红，表明肾血流阻断，45 min后重新恢复肾脏血液灌注，随后B组经腹腔静脉注射TGF-β1抗体(5 mg/kg)，A组经腹腔静脉注射等量的生理盐水。当松开动脉夹后肾脏在2～5 min内颜色由暗红转为鲜红表明缺血-再灌注损伤模型建立成功，肾血管无血栓形成，关腹。若超过5 min肾脏颜色仍然未转为鲜红色则认为肾脏有血栓形成，排除出实验组。实验大鼠麻醉清醒后转入代谢笼内自由进水及进食。再灌注达相应时间点时，从各小组大鼠腹主动脉取血2 ml备测血尿素氮(BUN)和血肌酐(Cr)，然后迅速切除左肾，置于冰盐水中，洗净表面血液，肾组织用 10%甲醛固定，制备石蜡切片。
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1.3 指标检测
1.3.1 肾功能检测 所取血液标本1500 r/min离心30 min，用微量加样器吸取上清，置于EP管中，4 ℃保存于冰箱中。肌酐、尿素氮检测由温州医学院附属二院检验科协助完成。
1.3.2 病理学检验 制备肾组织石蜡切片，经HE染色后，光镜下观察肾组织病理改变。
1.3.3 免疫组织化学分析 石蜡切片经免疫组化处理后，采用Image Plus Pro 6.0软件分析免疫组化结果：视野里棕黄色颗粒视为阳性着色，根据着色深浅程度分级：无着色(阴性)，浅黄色(弱阳性)，棕黄色(阳性)，深棕黄色(强阳性)。
1.4 统计学方法
采用SPSS 12 for Windows软件包对实验数据进行统计学处理。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采取方差分析的方法，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
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2 结果
2.1 肾功能变化
与同一时间点A组比较，0 h组A、B两组血浆BUN差异无统计学意义，其余B组各时间点血浆BUN均显著降低(P<0.05，见表1)；同组内不同时间点间BUN的比较：在A组中，各时间点之间比较差异具有统计学意义(F=98.622，P<0.01)，随再灌注时间的延长，任一时间点均较前时间点BUN明显升高，差异具有统计学意义(均P<0.05)。治疗组中随再灌注时间延长，BUN逐渐升高，各时间点间差异具有统计学意义(F=55.100，P<0.01)。
与同一时间点A组比较，0 h A、B两组血浆Cr差异无统计学意义，其余B组各时间点血浆Cr均显著降低(P<0.05，见表2)；同组内不同时间点间血Cr的比较：在A组中，各时间点之间比较差异具有统计学意义(F=115.205，P<0.01)。其中，随再灌注时间的延长，任一时间点均较前时间点Cr明显升高，差异具有统计学意义(均P<0.05)。B组中随再灌注时间延长，Cr逐渐升高，各时间点间差异具有统计学意义(F=60.119，P<0.01)。
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2.2 肾组织形态改变
假手术组肾小球、肾小管结构完整。肾IR模型组肾脏病理变化明显，多数肾小管上皮细胞肿胀，出现水样变性，部分凝固性坏死、脱落，刷状缘消失，肾小管腔内可见管型，肾间质血管高度扩张充血，可见灶性出血区和灶性炎细胞浸润，但肾小球病变不明显。见图1。
2.3 各组肾组织中Smad7表达情况
在0 h时间点肾脏Smad7阳性表达两组表达差异无统计学意义(P>0.05)。B组肾脏Smad7阳性表达较A组在4、12、24 h均增多(均P<0.05)。A组中，各时间点之间比较差异具有统计学意义(F=134.833，P<0.01)。其中，再灌注0 h组Smad7表达的平均光密度较其他各组明显大，差异具有统计学意义(P<0.01)，24 h组较4、12 h的平均光密度较大(P<0.01)，4 h和12 h组平均光密度差异无统计学意义(P>0.05)；B组在0、4、12 h肾内Smad7的表达随再灌注时间延长也逐渐减少(P<0.01)，再灌注24 h组平均光密度较其余时间点组明显增大，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表3和图2。, 百拇医药(徐俊南 王荣荣 李志涛 王征 龚裕强 孙来芳 陈大庆)