膜型基质金属蛋白酶—1表达对肝细胞癌血管生成拟态形成的影响(2)

http://www.100md.com 2014年12月25日 中国医药导报2014年第36期

     Bel7402细胞株在含10%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，置于37℃含5%CO2的温箱中。细胞分为两组：siRNA组使用RNA干扰质粒载体进行转染；阴性对照组使用阴性对照质粒转染；使用Lipofectamine 2000TM脂质体进行质粒转染。转染24 h后，消化贴壁生长的Bel7402细胞，1000 r/min离心5 min， 离心半径为13.5 cm。收集细胞，PBS 洗涤两次，转移至EP管中，5000 r/min离心1 min，弃去上清。使用Trizol抽提总mRNA，按说明书使用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA分子。根据PCR引物设计的原则，软件设计 PCR引物：上游5′-CTGCCTACCGACAAGATTGATG-3′；下游 5′-TCCCTTCCCAGACTT-TGATGTT-3′实时荧光定量PCR检测各组细胞中MT1-MMP mRNA表达，磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参，每个样本做3个复孔。结果采用2-△△CT法分析。

    按蛋白抽提试剂盒说明书操作，抽提各组细胞的总蛋白，并用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) ......