siRNA干扰SIAH对细胞活性和α—synuclein泛素化降解通路的影响(3)
1.2.8 免疫共聚焦法观察SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后SIAH、LC3、α-synuclein的共定位 将SH-SY5Y细胞以1×105/mL种于共聚焦培养皿中，转染方法同前，转染24 h后PBS冲洗干净，用4%多聚甲醛固定15 min，弃之，用pbs冲洗10 min×3遍。Trion-X-100打孔20 min，PBS冲洗10 min×3遍。5%的BSA封闭1 h(37 ℃培箱，BSA用PBS配制)，PBS洗10 min×3遍。一抗孵育4度过夜SIAH(1∶100 SantaCruz America)、α-synuclein(1∶100 Abcam USA)、LC3(1∶200 Abcam USA)，回收一抗，PBS洗10 min
×3遍，二抗孵育37℃ 2 h，PBS洗10 min×3遍，DAPI染10 min，PBS10 min×3遍，用蔡司共聚焦显微镜观察其定位情况。
1.3 统计学处理 使用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料采用(x±s)表示，多组间比较使用单向方差分析(ANOVA，LSD)，以P<0.05为差异有统计学意义，PCR结果利用2-ΔΔCt法统计数据。
, 百拇医药
2 结果
2.1 流式测转染率 用FAM转染SH-SY5Y细胞6 h后，用流式测转染率，其转染率可达89%。
2.2 siRNA干扰SIAH对SH-SY5Y细胞SIAH蛋白表达的抑制 转染不同siRNA序列对SIAH蛋白表达的影响转染72 h后SIAH蛋白western blot电泳图，用Image J分析条带灰度值，并用β-actin做标准化，转染siRNA-1#组、siRNA-2#组、siRNA-3#序列后，转染siRNA-2#组后SIAH蛋白表达低于阴性对照组和空白对照组，即筛选siRNA-2#组进行如下研究。
2.3 CCK-8法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后细胞活性 CCK-8法检测转染siRNA-2#序列后与空白对照组和阴性对照组细胞活性相比，转染SIAH-siRNA 48 h后SH-SY5Y细胞活性比空白对照组、阴性对照组均有显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，而空白对照组与阴性对照组之间变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。
, http://www.100md.com
2.4 流式法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后细胞凋亡 流式法检测转染siRNA-2#序列后与正常细胞组和阴性对照组细胞凋亡率相比，转染SIAH-siRNA 24 h后SH-SY5Y细胞凋亡率比空白对照组、阴性对照组均有显著减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，而空白对照组与阴性对照组之间变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。
2.5 Western Blot法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后蛋白表达水平 与空白对照组相比，siRNA-2#组的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ、P53蛋白水平均下降(t=2.931、3.307、5.506、3.326，P=0.0408、0.0297、0.0053、0.0292，)，E1表达升高(t=3.480，P=0.0254)；与阴性对照组相比较，siRNA-SIAH组的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ、P53蛋白水平均下降(t=5.178、4.851、5.941、4.400，P=0.0066、0.0083、0.0040、0.0117)，E1表达升高(t=3.765，P=0.0197)，见图3～7。
, http://www.100md.com
2.6 qRT-PCR法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后mRNA表达水平 siRNA-SIAH组与空白对照组相比，SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ的mRNA水平均下降(t=11.04、16.70、12.98，P<0.05)，E1表达升高(t=8.739，P=0.0128)；与阴性对照组相比较，siRNA-SIAH组的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ的mRNA水平均下降(t=6.066、16.58、4.043，P=0.0009、0.0036、0.0040)，E1表达升高(t=9.170，P=0.0117)，见图8。
2.7 免疫共聚焦法观察SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后SIAH、LC3、α-synuclein的共定位 将SIAH-siRNA干扰SH-SY5Y细胞后，SIAH与α-synuclein的信号强度减弱，且SIAH与α-synuclein失去共定位，表明干扰SIAH基因能使α-synuclein聚集减少；将SIAH-siRNA干扰SH-SY5Y细胞后，LC3-Ⅱ与α-synuclein的信号强度减弱，表明干扰SIAH基因，导致自噬溶酶体成熟障碍。
, 百拇医药
3 讨论
帕金森病的主要病理学标志为黑质致密部神经体内Lewy小体，异常的α-synuclein聚集是Lewy小体的重要组分，因此α-synuclein聚集是帕金森发生、发展的一个中心环节[6]。α-synuclein有不规则聚集体、可溶性寡聚体或者类似小纤维三种主要存在形式，而这三个种类都有潜在的神经毒性，多数资料认为可溶性寡聚体表现出更大的细胞毒性而导致神经元丧失[7]。在正常神经元内，α-synuclein的生成与降解之间保持着动态平衡[8]。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system，UPS)和自噬-溶酶体途径(Autophagy-lysosome pathway，ALP)是机体正常修复或者清除异常蛋白的最主要两种路径。蛋白酶体是一桶状多蛋白复合体，主要降解短寿的细胞核与细胞质蛋白，然而底物需要展开并通过蛋白酶体圆柱体狭窄的孔隙，这阻碍了低聚物和聚集蛋白的清除[9-10]。自噬是在溶酶体内清除细胞内变构和错误折叠的易聚集蛋白，这些蛋白多聚体对神经元有毒性并最终导致神经元的死亡，而自噬功能障碍可能是这些蛋白在受损神经元内积聚的主要原因[8]。研究表明，自噬途径主要降解不可溶性聚集蛋白，而UPS可以降解可溶性α-synuclein[11-12]。蛋白酶体通路可以清除经多聚泛素化后的α-synuclein，体内和体外实验研究表明，E3泛素连接酶—SIAH(Seven in absentia homolog)能够使α-synuclein 中的赖氨酸泛素化，并能够促进其聚集而对细胞产生毒性作用[13]。而SIAH所介导的α-synuclein单泛素化形成的聚集体只能通过自噬途径降解，因此笔者猜测可以通过干扰SIAH功能而减少α-synuclein的聚集及Lewy的形成，为PD的治疗提供新的方案。, http://www.100md.com(徐晶等)
×3遍，二抗孵育37℃ 2 h，PBS洗10 min×3遍，DAPI染10 min，PBS10 min×3遍，用蔡司共聚焦显微镜观察其定位情况。
1.3 统计学处理 使用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料采用(x±s)表示，多组间比较使用单向方差分析(ANOVA，LSD)，以P<0.05为差异有统计学意义，PCR结果利用2-ΔΔCt法统计数据。
, 百拇医药
2 结果
2.1 流式测转染率 用FAM转染SH-SY5Y细胞6 h后，用流式测转染率，其转染率可达89%。
2.2 siRNA干扰SIAH对SH-SY5Y细胞SIAH蛋白表达的抑制 转染不同siRNA序列对SIAH蛋白表达的影响转染72 h后SIAH蛋白western blot电泳图，用Image J分析条带灰度值，并用β-actin做标准化，转染siRNA-1#组、siRNA-2#组、siRNA-3#序列后，转染siRNA-2#组后SIAH蛋白表达低于阴性对照组和空白对照组，即筛选siRNA-2#组进行如下研究。
2.3 CCK-8法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后细胞活性 CCK-8法检测转染siRNA-2#序列后与空白对照组和阴性对照组细胞活性相比，转染SIAH-siRNA 48 h后SH-SY5Y细胞活性比空白对照组、阴性对照组均有显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，而空白对照组与阴性对照组之间变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。
, http://www.100md.com
2.4 流式法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后细胞凋亡 流式法检测转染siRNA-2#序列后与正常细胞组和阴性对照组细胞凋亡率相比，转染SIAH-siRNA 24 h后SH-SY5Y细胞凋亡率比空白对照组、阴性对照组均有显著减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，而空白对照组与阴性对照组之间变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。
2.5 Western Blot法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后蛋白表达水平 与空白对照组相比，siRNA-2#组的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ、P53蛋白水平均下降(t=2.931、3.307、5.506、3.326，P=0.0408、0.0297、0.0053、0.0292，)，E1表达升高(t=3.480，P=0.0254)；与阴性对照组相比较，siRNA-SIAH组的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ、P53蛋白水平均下降(t=5.178、4.851、5.941、4.400，P=0.0066、0.0083、0.0040、0.0117)，E1表达升高(t=3.765，P=0.0197)，见图3～7。
, http://www.100md.com
2.6 qRT-PCR法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后mRNA表达水平 siRNA-SIAH组与空白对照组相比，SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ的mRNA水平均下降(t=11.04、16.70、12.98，P<0.05)，E1表达升高(t=8.739，P=0.0128)；与阴性对照组相比较，siRNA-SIAH组的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ的mRNA水平均下降(t=6.066、16.58、4.043，P=0.0009、0.0036、0.0040)，E1表达升高(t=9.170，P=0.0117)，见图8。
2.7 免疫共聚焦法观察SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后SIAH、LC3、α-synuclein的共定位 将SIAH-siRNA干扰SH-SY5Y细胞后，SIAH与α-synuclein的信号强度减弱，且SIAH与α-synuclein失去共定位，表明干扰SIAH基因能使α-synuclein聚集减少；将SIAH-siRNA干扰SH-SY5Y细胞后，LC3-Ⅱ与α-synuclein的信号强度减弱，表明干扰SIAH基因，导致自噬溶酶体成熟障碍。
, 百拇医药
3 讨论
帕金森病的主要病理学标志为黑质致密部神经体内Lewy小体，异常的α-synuclein聚集是Lewy小体的重要组分，因此α-synuclein聚集是帕金森发生、发展的一个中心环节[6]。α-synuclein有不规则聚集体、可溶性寡聚体或者类似小纤维三种主要存在形式，而这三个种类都有潜在的神经毒性，多数资料认为可溶性寡聚体表现出更大的细胞毒性而导致神经元丧失[7]。在正常神经元内，α-synuclein的生成与降解之间保持着动态平衡[8]。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system，UPS)和自噬-溶酶体途径(Autophagy-lysosome pathway，ALP)是机体正常修复或者清除异常蛋白的最主要两种路径。蛋白酶体是一桶状多蛋白复合体，主要降解短寿的细胞核与细胞质蛋白，然而底物需要展开并通过蛋白酶体圆柱体狭窄的孔隙，这阻碍了低聚物和聚集蛋白的清除[9-10]。自噬是在溶酶体内清除细胞内变构和错误折叠的易聚集蛋白，这些蛋白多聚体对神经元有毒性并最终导致神经元的死亡，而自噬功能障碍可能是这些蛋白在受损神经元内积聚的主要原因[8]。研究表明，自噬途径主要降解不可溶性聚集蛋白，而UPS可以降解可溶性α-synuclein[11-12]。蛋白酶体通路可以清除经多聚泛素化后的α-synuclein，体内和体外实验研究表明，E3泛素连接酶—SIAH(Seven in absentia homolog)能够使α-synuclein 中的赖氨酸泛素化，并能够促进其聚集而对细胞产生毒性作用[13]。而SIAH所介导的α-synuclein单泛素化形成的聚集体只能通过自噬途径降解，因此笔者猜测可以通过干扰SIAH功能而减少α-synuclein的聚集及Lewy的形成，为PD的治疗提供新的方案。, http://www.100md.com(徐晶等)