FISH检测痰脱落细胞3、8、9、17染色体异常情况，研究肺癌诊断新手段(2)
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2014年6月-2015年6月本院收治的疑似肺癌患者30例作为研究对象，其中女10例，男20例，年龄45～78岁，中位年龄65岁。经病理学诊断证实为肺癌24例，其中鳞癌14例，小细胞肺癌3例，腺癌7例；TMN分期：Ⅰ～Ⅱ期9例，Ⅲ～Ⅳ期15例。良性病变6例，其中肺炎3例，肺结核3例。
1.2 方法 收集新鲜痰液，嘱患者晨起后去除口腔唾液，陈腐痰及鼻腔分泌物，并咯出喉部痰液，取漱口后深呼吸用力咯出的肺部痰液2～3口，连续3 d，留置于无菌盛痰瓶中，每例收集约20 mL，分为2等份各为10 mL，送检处理，分别用于FISH检测和常规痰细胞检测，具体方法如下。
1.2.1 FISH检测
1.2.1.1 痰标本的制备 将收集到的10 mL新鲜痰液放入置有Sacco manno固定液的试管固定[6]。用搅拌棒搅匀后，1500 r/min，离心10 min弃去上清，0.25%胶蛋白酶室温消化10 min后，加入血清终止消化，1500 r/min，离心10 min弃去上清。PBS洗涤后，1500 r/min，离心10 min弃去上清，用Sacco manno固定液重悬细胞，滴在载玻片上。
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1.2.1.2 探针选择 选择3、8、9和17号染色体为研究对象进行标记和检测。杂交时3号和17号为一组，8号和9号为一组做双色荧光原位杂交，3、8号标记为红色，9、17号标记为绿色。
1.2.1.3 FISH实验 (1)探针杂交混合物配制：将1×标准柠檬酸盐溶液(SSC)、55%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、1 mg/mL鲑鱼精DNA配成20 ng/mL探针杂交混合物。(2)探针变性：将配好的探针杂交混合物于75 ℃水溶变性10 min，变性后立即入冰，加到染色体载玻片上染色。(3)载玻片的杂交前处理：70%乙酸处理10 min；PBS洗3次，5 min/次；100 mg/L核糖核酸酶A，2×SSC 37 ℃消化60 min，2×SSC洗3次，5 min/次；70%、90%、100%乙醇梯度脱水处理各3 min，风干；70%甲酰胺、2×SSC 75 ℃变性各3 min；立即入冷70%、90%、100%乙醇脱水各处理3 min，风干。(4)杂交：将变性过的探针加到上述变性的载玻片上，rubber solution封片，放置在湿盒中37 ℃杂交过夜。(5)杂交后洗涤：杂交结束后，载玻片在42 ℃的50%甲酰胺，2×SSC中洗3次，5 min/次，2×SSC中洗3次，5 min/次。(6)检测：将玻片置于室温70%乙醇中洗涤3 min，取出后在暗处风干，在样本区域滴加15 μL DAPI，盖上盖玻片，避光保存15～20 min。(7)结果观察：用NIKON荧光显微镜观察结果。
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1.2.1.4 对照研究 上述4个染色体特异探针和8例健康人(其中男5例，女3例)的外周血细胞中期分裂染色体杂交，以确证各探针杂交的特异性并计数400个细胞中具有≤1个杂交信号和≥3个杂交信号的细胞比例，用于计算每个探针具有≤1个杂交信号和≥3的杂交信号的细胞的99%可信限(上限)，作为判定标本中异倍体的标准，选择具有某一杂交信号异常数目的细胞所占的比例≥10%作为制定异常信号的标准。
1.2.1.5 质量控制 每一批杂交试验都带一张正常血细胞的染色体片，若杂交后，正常染色体片中各探针具有2个杂交信号的比例明显低于对照研究中的平均比例，或杂交信号很多，难以分辨，则视为该次杂交失败，弃之重新杂交。
1.2.2 痰脱落细胞学检测 将收集好的患者新鲜痰液10 mL标本送常规细胞病理学检查，连送3 d。
1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件对所得数据进行分析，计数资料以率(%)表示，比较采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
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2 结果
2.1 对照研究 计算出的99%可信限(上限)作为结果判定的标准：即患者标本中具有1个3、8、9、17号染色体杂交信号的细胞所占的百分比分别为≥3.83%、≥3.61%、≥4.73%、≥3.77%时视为丢失；有≥3个3、8、9、17号染色体杂交信号的细胞所占的百分比分别为≥4.72%、≥4.84%、≥2.75%、≥4.91%时视为染色体拷贝数增多，见表1。
2.2 肺癌患者染色体畸变分析及探针诊断肺癌 肺癌患者新鲜痰液中染色体均存在不同程度的畸变：3号染色体表现为单体、三体、四体或者多体或3p缺失；8号染色体表现为单体，三体，四体或多体，也可表现为8p；9号染色体多表现为9p缺失，也可表现为完全缺失；17号染色体表现为三体、四体或多体。3、8、9、17号染色体探针单独使用敏感度均低于4种染色体探针联合使用，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。
2.3 FISH与痰脱落细胞学检测肺癌的敏感度和特异性比较 FISH检测的敏感度、诊断符合率均高于痰脱落细胞学检测，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。
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3 讨论
肺癌死亡率居高不下的主要原因在于多数肺癌患者确诊时已是晚期，即使采用综合治疗方法，患者治愈率仍不尽如人意[7]。如何提高肺癌早期诊断率成为降低肺癌高死亡率的重要课题。痰是气管或支气管的分泌物和肺泡的渗出物借助于支气管黏膜上皮纤毛运动，管壁平滑肌的收缩和咳嗽的气流的口腔排出物。利用痰细胞学检查诊断技术是肺癌高发人群进行防癌筛查的一种常规检测手段，但痰脱落细胞学检查肺癌检出率较低，特异性较差[8]。因此寻找一种特异性和敏感性较高，可辅助痰脱落细胞学检查诊断肺癌的方法，成为肺癌早期诊断研究的新方向。
相关研究结果表明，肺癌的发展与染色体不稳定性密切相关，特别是与3、8、9、17号染色体的非整倍体有关。3号染色体短臂(3p)和9号染色体短臂(9p)上遗传物质丢失是早期肺癌发生发展过程中的频发事件[9]。高树庚等[10]用FISH对21例非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)短期培养的肺癌组织和癌旁支气管上皮细胞中3p和9p丢失进行分析，21例中均检测到3p或9p丢失，3p和9p共同丢失率为57.14%(12/21)，3p或9p单独丢失率为42.86%(9/21)，9p丢失率在肺癌组织和癌旁支气管上皮细胞中均比3p高，提示肺癌发生发展过程中9p丢失发生可能性更大。, http://www.100md.com(李林)
1.1 一般资料 选择2014年6月-2015年6月本院收治的疑似肺癌患者30例作为研究对象，其中女10例，男20例，年龄45～78岁，中位年龄65岁。经病理学诊断证实为肺癌24例，其中鳞癌14例，小细胞肺癌3例，腺癌7例；TMN分期：Ⅰ～Ⅱ期9例，Ⅲ～Ⅳ期15例。良性病变6例，其中肺炎3例，肺结核3例。
1.2 方法 收集新鲜痰液，嘱患者晨起后去除口腔唾液，陈腐痰及鼻腔分泌物，并咯出喉部痰液，取漱口后深呼吸用力咯出的肺部痰液2～3口，连续3 d，留置于无菌盛痰瓶中，每例收集约20 mL，分为2等份各为10 mL，送检处理，分别用于FISH检测和常规痰细胞检测，具体方法如下。
1.2.1 FISH检测
1.2.1.1 痰标本的制备 将收集到的10 mL新鲜痰液放入置有Sacco manno固定液的试管固定[6]。用搅拌棒搅匀后，1500 r/min，离心10 min弃去上清，0.25%胶蛋白酶室温消化10 min后，加入血清终止消化，1500 r/min，离心10 min弃去上清。PBS洗涤后，1500 r/min，离心10 min弃去上清，用Sacco manno固定液重悬细胞，滴在载玻片上。
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1.2.1.2 探针选择 选择3、8、9和17号染色体为研究对象进行标记和检测。杂交时3号和17号为一组，8号和9号为一组做双色荧光原位杂交，3、8号标记为红色，9、17号标记为绿色。
1.2.1.3 FISH实验 (1)探针杂交混合物配制：将1×标准柠檬酸盐溶液(SSC)、55%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、1 mg/mL鲑鱼精DNA配成20 ng/mL探针杂交混合物。(2)探针变性：将配好的探针杂交混合物于75 ℃水溶变性10 min，变性后立即入冰，加到染色体载玻片上染色。(3)载玻片的杂交前处理：70%乙酸处理10 min；PBS洗3次，5 min/次；100 mg/L核糖核酸酶A，2×SSC 37 ℃消化60 min，2×SSC洗3次，5 min/次；70%、90%、100%乙醇梯度脱水处理各3 min，风干；70%甲酰胺、2×SSC 75 ℃变性各3 min；立即入冷70%、90%、100%乙醇脱水各处理3 min，风干。(4)杂交：将变性过的探针加到上述变性的载玻片上，rubber solution封片，放置在湿盒中37 ℃杂交过夜。(5)杂交后洗涤：杂交结束后，载玻片在42 ℃的50%甲酰胺，2×SSC中洗3次，5 min/次，2×SSC中洗3次，5 min/次。(6)检测：将玻片置于室温70%乙醇中洗涤3 min，取出后在暗处风干，在样本区域滴加15 μL DAPI，盖上盖玻片，避光保存15～20 min。(7)结果观察：用NIKON荧光显微镜观察结果。
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1.2.1.4 对照研究 上述4个染色体特异探针和8例健康人(其中男5例，女3例)的外周血细胞中期分裂染色体杂交，以确证各探针杂交的特异性并计数400个细胞中具有≤1个杂交信号和≥3个杂交信号的细胞比例，用于计算每个探针具有≤1个杂交信号和≥3的杂交信号的细胞的99%可信限(上限)，作为判定标本中异倍体的标准，选择具有某一杂交信号异常数目的细胞所占的比例≥10%作为制定异常信号的标准。
1.2.1.5 质量控制 每一批杂交试验都带一张正常血细胞的染色体片，若杂交后，正常染色体片中各探针具有2个杂交信号的比例明显低于对照研究中的平均比例，或杂交信号很多，难以分辨，则视为该次杂交失败，弃之重新杂交。
1.2.2 痰脱落细胞学检测 将收集好的患者新鲜痰液10 mL标本送常规细胞病理学检查，连送3 d。
1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件对所得数据进行分析，计数资料以率(%)表示，比较采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
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2 结果
2.1 对照研究 计算出的99%可信限(上限)作为结果判定的标准：即患者标本中具有1个3、8、9、17号染色体杂交信号的细胞所占的百分比分别为≥3.83%、≥3.61%、≥4.73%、≥3.77%时视为丢失；有≥3个3、8、9、17号染色体杂交信号的细胞所占的百分比分别为≥4.72%、≥4.84%、≥2.75%、≥4.91%时视为染色体拷贝数增多，见表1。
2.2 肺癌患者染色体畸变分析及探针诊断肺癌 肺癌患者新鲜痰液中染色体均存在不同程度的畸变：3号染色体表现为单体、三体、四体或者多体或3p缺失；8号染色体表现为单体，三体，四体或多体，也可表现为8p；9号染色体多表现为9p缺失，也可表现为完全缺失；17号染色体表现为三体、四体或多体。3、8、9、17号染色体探针单独使用敏感度均低于4种染色体探针联合使用，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。
2.3 FISH与痰脱落细胞学检测肺癌的敏感度和特异性比较 FISH检测的敏感度、诊断符合率均高于痰脱落细胞学检测，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。
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3 讨论
肺癌死亡率居高不下的主要原因在于多数肺癌患者确诊时已是晚期，即使采用综合治疗方法，患者治愈率仍不尽如人意[7]。如何提高肺癌早期诊断率成为降低肺癌高死亡率的重要课题。痰是气管或支气管的分泌物和肺泡的渗出物借助于支气管黏膜上皮纤毛运动，管壁平滑肌的收缩和咳嗽的气流的口腔排出物。利用痰细胞学检查诊断技术是肺癌高发人群进行防癌筛查的一种常规检测手段，但痰脱落细胞学检查肺癌检出率较低，特异性较差[8]。因此寻找一种特异性和敏感性较高，可辅助痰脱落细胞学检查诊断肺癌的方法，成为肺癌早期诊断研究的新方向。
相关研究结果表明，肺癌的发展与染色体不稳定性密切相关，特别是与3、8、9、17号染色体的非整倍体有关。3号染色体短臂(3p)和9号染色体短臂(9p)上遗传物质丢失是早期肺癌发生发展过程中的频发事件[9]。高树庚等[10]用FISH对21例非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)短期培养的肺癌组织和癌旁支气管上皮细胞中3p和9p丢失进行分析，21例中均检测到3p或9p丢失，3p和9p共同丢失率为57.14%(12/21)，3p或9p单独丢失率为42.86%(9/21)，9p丢失率在肺癌组织和癌旁支气管上皮细胞中均比3p高，提示肺癌发生发展过程中9p丢失发生可能性更大。, http://www.100md.com(李林)