糖尿病大鼠尿道α1受体和NGF/ProNGF异常表达的研究(3)
1.2.5 蛋白电泳(Western blotting) 尿道组织冰上快速匀浆，RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min 4 ℃离心20 min，BCA法测定总蛋白浓度，加入5×上样缓冲液煮沸4 min后-20 ℃保存。配置10%凝胶，每孔30 μg上样，待溴酚蓝电泳至凝胶底部时切断电流，将蛋白电转至PVDF膜上，5%奶粉封闭1 h后，加入一抗(兔抗大鼠α1A和α1D多克隆抗体，兔抗大鼠NGF抗体1∶500，兔抗大鼠P75受体抗体1∶500，兔抗大鼠β-Tubulin内参抗体1∶500)4 ℃过夜，TBST洗膜后加入羊抗兔二抗1∶4000 25 ℃ 2 h，Millipore发光液显色，Kodak2000M曝光系统采集和分析图像。
1.3 统计学处理 采用Excel建立数据，SPSS 18.0进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，比较采用t检验(t’检验)，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
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2.1 大鼠一般状况 糖尿病组大鼠多饮、多食、多尿症状显著，体重较对照组逐渐降低，解剖过程中发现腹部皮下脂肪含量较少，两组8周体重、膀胱尿道湿重、血糖及每日尿量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
2.2 膀胱尿道同步测压 尿流动力学检测显示(图1)，对照组和糖尿病组BP基线大致相等，分别为(13.36±1.34)cm H2O和(12.24±1.57)cm H2O，比较差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病组BP最高值(32.61±2.24)cm H2O显著低于对照组的(46.80±3.18)cm H2O，比较差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组BP基线在坦索罗辛应用后为(13.06±0.94)cm H2O，BP最高值在坦索罗辛应用后为(31.97±2.31)cm H2O，与应用前比较差异均无统计学意义(P>0.05)。对照组和糖尿病组UPP基线大致相等，分别为(50.13±1.27)cm H2O和(51.10±1.92)cm H2O，比较差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病组UPP最低值(35.21±2.67)cm H2O高于对照组的(16.80±1.28)cm H2O，比较差异有统计学意义(P<0.05)。应用坦索罗辛后，糖尿病组UPP基线(26.95±1.52)cm H2O显著低于应用坦索罗辛前，同时UPP最低值(15.74±2.43)cm H2O也显著低于应用坦索罗辛前，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。
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2.3 ELISA试验结果 糖尿病组NGF蛋白表达水平(52.05±7.77)pg/μg低于对照组的(99.59±10.76)pg/μg，比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。
2.4 RT-qPCR测定结果 糖尿病组大鼠尿道组织中NGF基因表达水平(0.164±0.020)低于对照组的(0.283±0.051)，比较差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组大鼠尿道组织中α1A基因表达水平(0.372±0.062)高于对照组的(0.095±0.013)，α1D基因表达水平(0.289±0.045)高于对照组的(0.127±0.014)，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组大鼠P75NTR受体基因表达水平(0.020±0.0067)低于对照组的(0.048±0.0103)，比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。
基因表达
2.5 蛋白电泳(Western blotting) 糖尿病组大鼠尿道组织中α1A蛋白表达水平(3.08±0.114)高于对照组的(0.34±0.059)，α1D蛋白表达水平(2.47±0.214)高于对照组的(0.29±0.064)，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组大鼠P75NTR受体蛋白表达水平(0.528±0.135)低于对照组的(1.007±0.113)，比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照组和糖尿病组sortilin蛋白表达水平分别为(1.147±0.093)和(1.056±0.135)，比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。
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3 讨论
本研究表明糖尿病可以导致尿道功能障碍，同时应用α1受体激动剂可以改善症状，通过检测尿道组织中α1受体的表达情况可以来解释上述现象。已有研究表明，交感和副交感神经在尿道平滑肌的神经支配中起着重要的作用，其中NGF起着桥梁的作用，同时NGF也对维持膀胱和尿道的感觉起重要作用。因此笔者研究NGF/proNGF通路，并且发现糖尿病大鼠尿道中NGF表达降低，proNGF表达上升。
众所周知，尿道括约肌包括交感和副交感神经支配的平滑肌，还有躯体运动神经支配的横纹肌。α1受体介导交感神经支配的尿道平滑肌收缩，NO介导副交感神经支配的尿道平滑肌舒张[5，7-8]。在本研究中，测量UPP的同时并未应用筒箭毒消除横纹肌的影响，但是α1受体拮抗剂的作用足以说明α1受体在糖尿病尿道功能障碍中起着重要作用。
NGF在交感神经和外周感觉神经的存活、生长和发育过程中起着重要的作用，与其他神经营养因子家族成员类似，组织首先合成30 KD proNGF，随后剪切合成14 KD成熟NGF。上述过程可以解释某些组织中NGF基因和蛋白的表达不一致。在中枢和外周神经组织中主要以porNGF的形式存在，成熟NGF的含量极低，之前的研究表明靶器官到神经的NGF的逆行轴浆运输可能在糖尿病神经病变中起着重要作用，同时proNGF介导神经元凋亡[12，14]。本研究同之前的几项研究结果一致，糖尿病大鼠组织中NGF的基因和蛋白表达水平均显著降低[17-18]。基于上述结果，曾有多项实验尝试外源性补充NGF来治疗糖尿病神经病变，取得一定疗效[19]。
组织中存在两类NGF受体：高亲和力的酪氨酸激酶受体A(TrkA)和P75NTR受体。前者与磷酯酶C、丝氨酸激活的蛋白激酶和PI3K通路相偶联，下游的效应器包括蛋白激酶B(Akt)、Bad、Foekhead1、Bcl-2和cAMP反应元件结合蛋白。其中，Akt在促进神经元存活过程中起着重要的作用[20]。尽管NGF可独立激活TrkA介导的信号通路，但是研究表明NGF结合P75NTR受体可以强化上述过程[21-23]。Roux等[24]的研究表明，P75NTR受体可以激活Akt通路，促进PC12细胞的存活。本研究记过表明NGF及其P75NTR受体表达的降低在糖尿病神经病变发病过程中起着重要作用，这与其他相关研究结果相吻合[18]。, 百拇医药(冯小迪 冀明 史本康)
1.3 统计学处理 采用Excel建立数据，SPSS 18.0进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，比较采用t检验(t’检验)，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
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2.1 大鼠一般状况 糖尿病组大鼠多饮、多食、多尿症状显著，体重较对照组逐渐降低，解剖过程中发现腹部皮下脂肪含量较少，两组8周体重、膀胱尿道湿重、血糖及每日尿量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
2.2 膀胱尿道同步测压 尿流动力学检测显示(图1)，对照组和糖尿病组BP基线大致相等，分别为(13.36±1.34)cm H2O和(12.24±1.57)cm H2O，比较差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病组BP最高值(32.61±2.24)cm H2O显著低于对照组的(46.80±3.18)cm H2O，比较差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组BP基线在坦索罗辛应用后为(13.06±0.94)cm H2O，BP最高值在坦索罗辛应用后为(31.97±2.31)cm H2O，与应用前比较差异均无统计学意义(P>0.05)。对照组和糖尿病组UPP基线大致相等，分别为(50.13±1.27)cm H2O和(51.10±1.92)cm H2O，比较差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病组UPP最低值(35.21±2.67)cm H2O高于对照组的(16.80±1.28)cm H2O，比较差异有统计学意义(P<0.05)。应用坦索罗辛后，糖尿病组UPP基线(26.95±1.52)cm H2O显著低于应用坦索罗辛前，同时UPP最低值(15.74±2.43)cm H2O也显著低于应用坦索罗辛前，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。
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2.3 ELISA试验结果 糖尿病组NGF蛋白表达水平(52.05±7.77)pg/μg低于对照组的(99.59±10.76)pg/μg，比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。
2.4 RT-qPCR测定结果 糖尿病组大鼠尿道组织中NGF基因表达水平(0.164±0.020)低于对照组的(0.283±0.051)，比较差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组大鼠尿道组织中α1A基因表达水平(0.372±0.062)高于对照组的(0.095±0.013)，α1D基因表达水平(0.289±0.045)高于对照组的(0.127±0.014)，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组大鼠P75NTR受体基因表达水平(0.020±0.0067)低于对照组的(0.048±0.0103)，比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。
基因表达
2.5 蛋白电泳(Western blotting) 糖尿病组大鼠尿道组织中α1A蛋白表达水平(3.08±0.114)高于对照组的(0.34±0.059)，α1D蛋白表达水平(2.47±0.214)高于对照组的(0.29±0.064)，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组大鼠P75NTR受体蛋白表达水平(0.528±0.135)低于对照组的(1.007±0.113)，比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照组和糖尿病组sortilin蛋白表达水平分别为(1.147±0.093)和(1.056±0.135)，比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。
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3 讨论
本研究表明糖尿病可以导致尿道功能障碍，同时应用α1受体激动剂可以改善症状，通过检测尿道组织中α1受体的表达情况可以来解释上述现象。已有研究表明，交感和副交感神经在尿道平滑肌的神经支配中起着重要的作用，其中NGF起着桥梁的作用，同时NGF也对维持膀胱和尿道的感觉起重要作用。因此笔者研究NGF/proNGF通路，并且发现糖尿病大鼠尿道中NGF表达降低，proNGF表达上升。
众所周知，尿道括约肌包括交感和副交感神经支配的平滑肌，还有躯体运动神经支配的横纹肌。α1受体介导交感神经支配的尿道平滑肌收缩，NO介导副交感神经支配的尿道平滑肌舒张[5，7-8]。在本研究中，测量UPP的同时并未应用筒箭毒消除横纹肌的影响，但是α1受体拮抗剂的作用足以说明α1受体在糖尿病尿道功能障碍中起着重要作用。
NGF在交感神经和外周感觉神经的存活、生长和发育过程中起着重要的作用，与其他神经营养因子家族成员类似，组织首先合成30 KD proNGF，随后剪切合成14 KD成熟NGF。上述过程可以解释某些组织中NGF基因和蛋白的表达不一致。在中枢和外周神经组织中主要以porNGF的形式存在，成熟NGF的含量极低，之前的研究表明靶器官到神经的NGF的逆行轴浆运输可能在糖尿病神经病变中起着重要作用，同时proNGF介导神经元凋亡[12，14]。本研究同之前的几项研究结果一致，糖尿病大鼠组织中NGF的基因和蛋白表达水平均显著降低[17-18]。基于上述结果，曾有多项实验尝试外源性补充NGF来治疗糖尿病神经病变，取得一定疗效[19]。
组织中存在两类NGF受体：高亲和力的酪氨酸激酶受体A(TrkA)和P75NTR受体。前者与磷酯酶C、丝氨酸激活的蛋白激酶和PI3K通路相偶联，下游的效应器包括蛋白激酶B(Akt)、Bad、Foekhead1、Bcl-2和cAMP反应元件结合蛋白。其中，Akt在促进神经元存活过程中起着重要的作用[20]。尽管NGF可独立激活TrkA介导的信号通路，但是研究表明NGF结合P75NTR受体可以强化上述过程[21-23]。Roux等[24]的研究表明，P75NTR受体可以激活Akt通路，促进PC12细胞的存活。本研究记过表明NGF及其P75NTR受体表达的降低在糖尿病神经病变发病过程中起着重要作用，这与其他相关研究结果相吻合[18]。, 百拇医药(冯小迪 冀明 史本康)