促血管生成素—2在肾细胞癌中的表达及其意义(2)
1.2 试剂 兔抗人Ang-2多克隆抗体及SP免疫组化试剂盒均购自博士德公司，一抗以1∶100稀释使用，步骤按说明书。DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。其他试剂取自山西医科大学第一临床医学院病理教研室。
1.3 免疫组织化学染色方法 所有标本经甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，H2O2阻断内源性过氧化物酶，枸橼酸盐微波高压抗原修复，滴加一抗置于37 ℃温箱孵育1 h，滴加二抗并于37 ℃温箱孵育30 min，PBS液洗涤3次，DAB底物显色，苏木素复染核，梯度酒精脱水，树脂胶封片，置于显微镜下观察，使用PBS液代替一抗作阴性对照。
1.4 判定标准 本研究在光镜下结合染色强度和阳性细胞百分比判断Ang-2在肾细胞癌中的阳性表达率。以肿瘤细胞胞浆或细胞膜上出现棕褐色颗粒为Ang-2阳性表达，染色愈浓代表阳性表达愈强。选取背景清晰的视野，在100倍显微镜下观察，按组织染色深浅分为：未染色记作0分；浅黄色记作1分；棕黄色记作2分；棕褐色记作3分。选取染色均匀的区域于400倍显微镜下观察，记录5个视野中阳性细胞的百分比，计算其平均值。按染色细胞的比例分为4分：0～25%记作0分；25%～50%记作1分；50%～75%记作2分；>75%记作3分。组织染色强度与染色细胞百分比级别之和3～6分为阳性，以上检测采用盲法独立检测。
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1.5 统计学处理 使用SPSS 15.0统计软件进行分析，计数资料采用 字2检验，小样本(n<40)比较采用Fisher’s精确概率法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Ang-2在肾细胞癌组织、癌旁组织及正常肾组织中的表达 免疫组化学染色Ang-2主要表达于细胞胞浆或细胞膜上(图1)，棕褐色颗粒状为阳性着色。50例RCC患者中Ang-2的阳性表达率为62.0%(31/50)，癌旁组织中Ang-2的阳性表达率为28.0%(14/50)，6例正常肾组织中Ang-2均无阳性表达。RCC中Ang-2阳性表达率明显高于癌旁组织及正常组织，差异均有统计学意义(P<0.05)；Ang-2阳性表达率在癌旁组织与正常肾组织中比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。
2.2 Ang-2的表达与患者临床病理因素的关系 在50例RCC患者中，男性组Ang-2阳性表达率为60.7%(17/28)，女性组Ang-2阳性表达率为63.6%(14/22)，两组比较差异无统计学意义( 字2=0.01，P>0.05)；60岁以下组Ang-2阳性表达率为70.8%(17/24)，60岁以上组Ang-2阳性表达率为53.8%(14/26)，两组比较差异无统计学意义( 字2=1.53，P>0.05)；术前有血尿组Ang-2阳性表达率为85.7%(12/14)，术前无血尿组Ang-2阳性表达率为52.8%(19/36)，两组比较差异有统计学意义( 字2=4.64，P<0.05)；临床分期为Ⅰ～Ⅱ期组Ang-2阳性表达率为51.4%(19/37)，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期组Ang-2阳性表达率为92.3%(12/13)，两组比较差异有统计学意义( 字2=5.22，P<0.05)。
, 百拇医药
3 讨论
肿瘤的发生、发展、侵袭及转移都离不开新生血管的生成，新生血管网给肿瘤提供充足的血液供应、清除代谢产物的同时，在肿瘤的侵袭和转移过程中亦发挥着重要作用。研究发现，丰富的新生血管不仅使肿瘤细胞进入血液循环的机会增加，而且可以促进肿瘤细胞侵入邻近的淋巴管，从而发生淋巴转移，此外新生血管的基底膜容易渗漏，肿瘤细胞易穿透血管基底膜而发生远处转移[3]。辛华等[4]研究表明，肿瘤在缺乏新生血管的情况下，其发展、侵袭及转移的可能性均较小。肿瘤诱发血管的聚集和生成与肿瘤细胞本身释放的一类促血管生成因子密切相关。肿瘤新生血管的生成是一个多步骤、多因素的复杂过程，受多种血管生成因子及抑制因子的调控。促血管生成素(Angiopoietins，Ang)是新发现的一类具有受体促进剂及抑制剂的促进血管生成因子，主要由血管内皮细胞分泌产生，作用于Tie2受体，与其他血管生成促进因子共同发挥作用，其中Ang-1、Ang-2与肿瘤血管生成的关系最为密切，其分子结构相似，但生物学功能相反[5-6]。Ang-2基因位于8p23，编码496个氨基酸，与Ang-1有近60%的同源性，与Tie2受体结合而发挥作用[7]。Ang-2通过竞争性抑制Ang-1与Tie2相互作用而参与到血管的重塑，破坏血管的稳定性。在成人正常组织中，Ang-2分布于子宫、胎盘和卵巢等组织中，可能与上述组织生理过程中的血管重建有关[8]。但在病理情况下，Ang-2可表达于炎症、创伤以及肿瘤部位，参与上述部位的血管重建及组织修复过程，而在肿瘤组织中的表达，可能与肿瘤发生、发展、转移和侵袭等密切相关[9]。
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目前有关肿瘤生长的研究认为，在早期肿瘤细胞形成所需要的血供和机体正常组织血供为同一来源，相互竞争，但由于肿瘤细胞的特点为高代谢、快速生长，所以其竞争血供的能力远强于机体正常组织，为阻止肿瘤细胞的生长，机体则分泌Ang-2使肿瘤占据的血管发生退化，起到自杀性防御的作用[10]。所以早期血管不随肿瘤的发生发展而增生，而是发生退化，此时Ang-2高表达，而VEGF的表达无明显变化[11]。后期由于肿瘤血管退化、血供减少，组织缺氧坏死，从而诱发VEGF的表达增加，同时Ang-2阻断Ang-1的血管稳定性作用，使血管内皮对生长因子的敏感性增强，促进血管重建。所以后期肿瘤血管增生显著，此时Ang-2及VEGF表达均明显增多。在肿瘤的发生发展过程中原有成熟血管发生了退化，肿瘤新生血管开始生成。Ang-2的表达增加可认为是肿瘤血管新生的标志，意味着肿瘤细胞的快速增长并易发生转移。
在人体正常组织中，Ang-2仅存在于女性生殖系统等部分血管重建部位，而其他正常成熟组织中呈无表达或轻微表达。病理情况下，Ang-2表达上调已在胃癌、食管癌及肝癌等多种肿瘤中得以证实。在细胞癌变过程的早期，Ang-2的表达增多，与肿瘤侵袭性及患者预后不良有关[12-13]。本研究结果显示，Ang-2在RCC组织中的表达率较癌旁组织及正常肾组织明显增高；Ang-2在血尿组中的阳性表达率高于无血尿组；Ang-2在临床分期Ⅲ～Ⅳ期组中的阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期组，提示Ang-2的高表达可以诱导肿瘤血管的形成，进而参与了RCC的增殖、浸润及转移等恶性生物学行为的调节。, 百拇医药(杨文杰 刘尚莹 陈强 王杰)
1.3 免疫组织化学染色方法 所有标本经甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，H2O2阻断内源性过氧化物酶，枸橼酸盐微波高压抗原修复，滴加一抗置于37 ℃温箱孵育1 h，滴加二抗并于37 ℃温箱孵育30 min，PBS液洗涤3次，DAB底物显色，苏木素复染核，梯度酒精脱水，树脂胶封片，置于显微镜下观察，使用PBS液代替一抗作阴性对照。
1.4 判定标准 本研究在光镜下结合染色强度和阳性细胞百分比判断Ang-2在肾细胞癌中的阳性表达率。以肿瘤细胞胞浆或细胞膜上出现棕褐色颗粒为Ang-2阳性表达，染色愈浓代表阳性表达愈强。选取背景清晰的视野，在100倍显微镜下观察，按组织染色深浅分为：未染色记作0分；浅黄色记作1分；棕黄色记作2分；棕褐色记作3分。选取染色均匀的区域于400倍显微镜下观察，记录5个视野中阳性细胞的百分比，计算其平均值。按染色细胞的比例分为4分：0～25%记作0分；25%～50%记作1分；50%～75%记作2分；>75%记作3分。组织染色强度与染色细胞百分比级别之和3～6分为阳性，以上检测采用盲法独立检测。
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1.5 统计学处理 使用SPSS 15.0统计软件进行分析，计数资料采用 字2检验，小样本(n<40)比较采用Fisher’s精确概率法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Ang-2在肾细胞癌组织、癌旁组织及正常肾组织中的表达 免疫组化学染色Ang-2主要表达于细胞胞浆或细胞膜上(图1)，棕褐色颗粒状为阳性着色。50例RCC患者中Ang-2的阳性表达率为62.0%(31/50)，癌旁组织中Ang-2的阳性表达率为28.0%(14/50)，6例正常肾组织中Ang-2均无阳性表达。RCC中Ang-2阳性表达率明显高于癌旁组织及正常组织，差异均有统计学意义(P<0.05)；Ang-2阳性表达率在癌旁组织与正常肾组织中比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。
2.2 Ang-2的表达与患者临床病理因素的关系 在50例RCC患者中，男性组Ang-2阳性表达率为60.7%(17/28)，女性组Ang-2阳性表达率为63.6%(14/22)，两组比较差异无统计学意义( 字2=0.01，P>0.05)；60岁以下组Ang-2阳性表达率为70.8%(17/24)，60岁以上组Ang-2阳性表达率为53.8%(14/26)，两组比较差异无统计学意义( 字2=1.53，P>0.05)；术前有血尿组Ang-2阳性表达率为85.7%(12/14)，术前无血尿组Ang-2阳性表达率为52.8%(19/36)，两组比较差异有统计学意义( 字2=4.64，P<0.05)；临床分期为Ⅰ～Ⅱ期组Ang-2阳性表达率为51.4%(19/37)，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期组Ang-2阳性表达率为92.3%(12/13)，两组比较差异有统计学意义( 字2=5.22，P<0.05)。
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3 讨论
肿瘤的发生、发展、侵袭及转移都离不开新生血管的生成，新生血管网给肿瘤提供充足的血液供应、清除代谢产物的同时，在肿瘤的侵袭和转移过程中亦发挥着重要作用。研究发现，丰富的新生血管不仅使肿瘤细胞进入血液循环的机会增加，而且可以促进肿瘤细胞侵入邻近的淋巴管，从而发生淋巴转移，此外新生血管的基底膜容易渗漏，肿瘤细胞易穿透血管基底膜而发生远处转移[3]。辛华等[4]研究表明，肿瘤在缺乏新生血管的情况下，其发展、侵袭及转移的可能性均较小。肿瘤诱发血管的聚集和生成与肿瘤细胞本身释放的一类促血管生成因子密切相关。肿瘤新生血管的生成是一个多步骤、多因素的复杂过程，受多种血管生成因子及抑制因子的调控。促血管生成素(Angiopoietins，Ang)是新发现的一类具有受体促进剂及抑制剂的促进血管生成因子，主要由血管内皮细胞分泌产生，作用于Tie2受体，与其他血管生成促进因子共同发挥作用，其中Ang-1、Ang-2与肿瘤血管生成的关系最为密切，其分子结构相似，但生物学功能相反[5-6]。Ang-2基因位于8p23，编码496个氨基酸，与Ang-1有近60%的同源性，与Tie2受体结合而发挥作用[7]。Ang-2通过竞争性抑制Ang-1与Tie2相互作用而参与到血管的重塑，破坏血管的稳定性。在成人正常组织中，Ang-2分布于子宫、胎盘和卵巢等组织中，可能与上述组织生理过程中的血管重建有关[8]。但在病理情况下，Ang-2可表达于炎症、创伤以及肿瘤部位，参与上述部位的血管重建及组织修复过程，而在肿瘤组织中的表达，可能与肿瘤发生、发展、转移和侵袭等密切相关[9]。
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目前有关肿瘤生长的研究认为，在早期肿瘤细胞形成所需要的血供和机体正常组织血供为同一来源，相互竞争，但由于肿瘤细胞的特点为高代谢、快速生长，所以其竞争血供的能力远强于机体正常组织，为阻止肿瘤细胞的生长，机体则分泌Ang-2使肿瘤占据的血管发生退化，起到自杀性防御的作用[10]。所以早期血管不随肿瘤的发生发展而增生，而是发生退化，此时Ang-2高表达，而VEGF的表达无明显变化[11]。后期由于肿瘤血管退化、血供减少，组织缺氧坏死，从而诱发VEGF的表达增加，同时Ang-2阻断Ang-1的血管稳定性作用，使血管内皮对生长因子的敏感性增强，促进血管重建。所以后期肿瘤血管增生显著，此时Ang-2及VEGF表达均明显增多。在肿瘤的发生发展过程中原有成熟血管发生了退化，肿瘤新生血管开始生成。Ang-2的表达增加可认为是肿瘤血管新生的标志，意味着肿瘤细胞的快速增长并易发生转移。
在人体正常组织中，Ang-2仅存在于女性生殖系统等部分血管重建部位，而其他正常成熟组织中呈无表达或轻微表达。病理情况下，Ang-2表达上调已在胃癌、食管癌及肝癌等多种肿瘤中得以证实。在细胞癌变过程的早期，Ang-2的表达增多，与肿瘤侵袭性及患者预后不良有关[12-13]。本研究结果显示，Ang-2在RCC组织中的表达率较癌旁组织及正常肾组织明显增高；Ang-2在血尿组中的阳性表达率高于无血尿组；Ang-2在临床分期Ⅲ～Ⅳ期组中的阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期组，提示Ang-2的高表达可以诱导肿瘤血管的形成，进而参与了RCC的增殖、浸润及转移等恶性生物学行为的调节。, 百拇医药(杨文杰 刘尚莹 陈强 王杰)