《生化与分子生物学实验》的动态教学初探(1)
[摘要] 生物化学与分子生物学是一门医学基础实验课程，为了进一步提供学生在实验课中的学习效果，本研究初探《生化与分子生物学实验》的教学内容重新编排，发现能更大的调动学生学习的积极性，理论掌握与动手能力得到提高。
[关键词] 生物化学；分子生物学；动态教学
[中图分类号] R-4 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616(2012)01-150-02
现代生物化学与分子生物学技术的发展，不仅推动了分子生物学理论在广度和深度2个方面的进展[1]，同时以基因工程为主导的生化与分子生物学技术，也已经进入产业化阶段，并推动着社会生产力的发展[2]。鉴于现代生物化学与分子生物学新技术的不断涌现，熟练掌握其实验操作技术，就成为生命科学工作者包括医疗工作者的基本素质要求，而实验教学是整个《生化与分子生物学》教学过程的重要环节[3]。本研究通过对实验课学生反馈与课程技术讨论总结，从生化与分子生物学实验教学的培养目标出发，针对目前第二军医大学实验教学的现状，以及传统实验教学模式显露出来的弊端进行分析，提出以下实验课程改革方案。
1 跳出理论与实践分离的教学模式
新课程，新理念，要求新的学习方法。先理论后实践，围绕分子生物学技术的基本过程，以人肿瘤坏死因子α(TNFα)在大肠杆菌中表达为主线，以“分、切、接、转、筛”五大步骤展开。第一节介绍抽提组织细胞的核酸，并以此为模板，利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)或反转录PCR(RT-PCR)的方法分离其编码DNA序列，即目的基因的获得(目的基因的“分”)；第二节为分离纯化质粒的各种方法，即载体的获得(载体的“分”)，然后目的基因与载体分别进行限制性核酸内切酶的酶切及回收与鉴定，即“切”；第三节为目的基因与载体以连接酶连接，然后转化感受态细胞，并以质粒所带的筛选标志进行筛选，即“接”“转”与“筛”。第四节对重组子进一步筛选，通过诱导表达重组子编码的产物(人TNFα)，然后进行分离鉴定重组蛋白质，这是根据表达产物的理化性质进一步“筛”；以及以蛋白质电泳(SDS-PAGE)为基础，从表达产物的分子量，免疫学性质、杀伤肿瘤细胞的生物学活性等方面进一步分析与鉴定重组表达产物，也是“筛”的过程。
2 导引曲径，由理论回到实验
围绕思维目标，指引思维的“曲径”，这“曲径”实际上是指不同角度、不同层次的思维指向。教学中，让学生沿着“曲径”逐层“探幽”，促其对思维目标的深层感悟，并从中引出实验课教学的重点-实验原理及操作。
2.1 第一节课：理论教授内容：TNF家族简介
(1)TNF配体及受体超家族基因结构特征：复习内含子，外显子，单拷贝基因，基因家族；(2)TNF配体及受体超家族分子结构：复习蛋白质结构层次，跨膜蛋白(Ⅰ、Ⅱ型)，信号肽；(3)TNF配体及受体超家族结构与功能关系：凋亡(形态、分子标志，信号转导过程)，坏死；信号转导的结构基础(蛋白质聚集，剪切，磷酸化等修饰)(重点)。
带着理论中存在的实验问题，回到实验中去掌握具体的实验原理及操作。(1)PCR原理：DNA合成，3步反应循环；(2)引物(探针)设计原理：11条，结合TNF可溶性编码序列的扩增引物讲解(重点)；(3)PCR扩增体系：各组分(特别是dNTP、Mg、Taq酶)，浓度，纯度要求，使用时注意点；(4)PCR扩增条件：温度、循环次数，各种类型PCR仪简介；(5)PCR衍生技术(T-A克隆、RT-PCR、荧光定量PCR等)和用途。
2.2 第二节课：理论教授内容
(1)质粒：概念，质粒不相容性；严紧性与松弛型质粒差别的基础；其他常用载体(重点)；(2)限制性内切酶：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ特征，Ⅱ型详介(回文结构、粘端、平端、同尾酶)(重点)；酶切图谱；(3)连接酶：T4 DNA连接酶，其他连接酶；(4)其他工具酶；(5)定向克隆；(6)细胞组分。同时对应本节带出的要掌握实验操作：(1)质粒抽提试剂盒原理、各溶液组分和作用，操作要点(重点)；(2)限制性内切酶反应条件，使用注意事项(甘油影响，质粒纯化时酒精残余的影响)；(3)凝胶回收试剂盒原理、各溶液组分和作用，操作要点；(4)连接酶反应条件，使用注意事项(彻底融化和溶解，温度，胶回收纯化时酒精残余的影响)；(5)电泳详解：各类电泳(琼脂糖凝胶电泳，薄膜电泳，SDS-PAGE等，水平式、垂直、管状、脉冲等)原理；核酸电泳操作要点(凝胶浓度，核酸浓度测算，分子量测算)，适用范围，注意事项(重点)。(6)细胞组分分离：破碎细胞方法(物理方法：反复冻融，超声，(高压)匀浆；化学方法：酸解，碱裂解(质粒抽提)；生物方法：各种酶解)。
2.3 第三节课：理论教授内容
(1)外源基因导入宿主方式(接合，转化，转染，转导，感染等)；感受态；(2)重组子筛选原理(质粒-抗性、生化标志，外源DNA片段，表达产物)。同时对应本节带出的要掌握的实验操作：(1)转化(CaCl2法)：操作要点：恒低温(0℃)保持，复苏温度与时间；(2)蓝白斑筛选。
2.4 第四节课：理论教授内容
(1)蛋白质的哪些性质可作为蛋白质分离纯化的依据？(2)重组蛋白表达的特性(包涵体的形成，融合表达，诱导表达)；(3)抗体简介：结构，类型(一抗，二抗；单抗，多抗，抗血清；(酶、荧光等)标记抗体)；(4)蛋白质功能研究策略。
同时对应本节带出的要掌握实验操作：(1)盐析：原理；分段盐析；(2)离心技术详解：转速(超速)，离心力；密度梯度离心；差速离心；温度，真空度；(3)层析：分子筛(分子量测算，纯度测算)(重点)；其他方法(离子层析，亲和层析，反相，HPLC等)；方法的选择；(4)SDS-PAGE(分子量测算，纯度测算)(重点)；Western-blot分析：操作要点(膜，电转移，封闭，显色：底物，化学发光，荧光)；(5)活性测定：分子相互作用分析；酶活性分析，细胞功能分析，动物模型分析。
2.5 第五节课：总复习
(1)分子克隆原理与流程总结；(2)基因功能研究策略：表达；表达调控；产物(蛋白质)结构，理化性质鉴定，相互作用，功能研究。
3 开放教学，注重思考
在教学中采用的是以小组为单位进行讨论，开展实验探索活动，以培养学生的探究能力。每节理论与操作课完成后预留部分时间，让学生带着思考回顾内容，在讨论中，每个成员是平等的，可以自由地发表个人的见解，通过讨论可以集思广益，互相合作，加速知识的同化。
3.1 第一节课思考题
(1)PCR时降低退火温度对反应有何影响？(2)PCR时延长变性时间对反应有何影响？(3)PCR时循环次数是否越多越好？为什么？(4)PCR时如果出现非特异性带，可能有哪些原因？(5)如要阐述某蛋白质分子的结构与功能，应如何展开？
3.2 第二节课思考题
(1)质粒的基本性质有哪些？(2)质粒载体与天然质粒相比有哪些改进？(3)在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题？(4)如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动，你认为可能是什么原因？(5)琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？(6)设计实验来判断双酶切时，证实2个限制性内切酶都起到了作用。
3.3 第三节课思考题, 百拇医药(钟山 高云 孙铭娟 杨生生 张建鹏 王梁华)
[关键词] 生物化学；分子生物学；动态教学
[中图分类号] R-4 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616(2012)01-150-02
现代生物化学与分子生物学技术的发展，不仅推动了分子生物学理论在广度和深度2个方面的进展[1]，同时以基因工程为主导的生化与分子生物学技术，也已经进入产业化阶段，并推动着社会生产力的发展[2]。鉴于现代生物化学与分子生物学新技术的不断涌现，熟练掌握其实验操作技术，就成为生命科学工作者包括医疗工作者的基本素质要求，而实验教学是整个《生化与分子生物学》教学过程的重要环节[3]。本研究通过对实验课学生反馈与课程技术讨论总结，从生化与分子生物学实验教学的培养目标出发，针对目前第二军医大学实验教学的现状，以及传统实验教学模式显露出来的弊端进行分析，提出以下实验课程改革方案。
1 跳出理论与实践分离的教学模式
新课程，新理念，要求新的学习方法。先理论后实践，围绕分子生物学技术的基本过程，以人肿瘤坏死因子α(TNFα)在大肠杆菌中表达为主线，以“分、切、接、转、筛”五大步骤展开。第一节介绍抽提组织细胞的核酸，并以此为模板，利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)或反转录PCR(RT-PCR)的方法分离其编码DNA序列，即目的基因的获得(目的基因的“分”)；第二节为分离纯化质粒的各种方法，即载体的获得(载体的“分”)，然后目的基因与载体分别进行限制性核酸内切酶的酶切及回收与鉴定，即“切”；第三节为目的基因与载体以连接酶连接，然后转化感受态细胞，并以质粒所带的筛选标志进行筛选，即“接”“转”与“筛”。第四节对重组子进一步筛选，通过诱导表达重组子编码的产物(人TNFα)，然后进行分离鉴定重组蛋白质，这是根据表达产物的理化性质进一步“筛”；以及以蛋白质电泳(SDS-PAGE)为基础，从表达产物的分子量，免疫学性质、杀伤肿瘤细胞的生物学活性等方面进一步分析与鉴定重组表达产物，也是“筛”的过程。
2 导引曲径，由理论回到实验
围绕思维目标，指引思维的“曲径”，这“曲径”实际上是指不同角度、不同层次的思维指向。教学中，让学生沿着“曲径”逐层“探幽”，促其对思维目标的深层感悟，并从中引出实验课教学的重点-实验原理及操作。
2.1 第一节课：理论教授内容：TNF家族简介
(1)TNF配体及受体超家族基因结构特征：复习内含子，外显子，单拷贝基因，基因家族；(2)TNF配体及受体超家族分子结构：复习蛋白质结构层次，跨膜蛋白(Ⅰ、Ⅱ型)，信号肽；(3)TNF配体及受体超家族结构与功能关系：凋亡(形态、分子标志，信号转导过程)，坏死；信号转导的结构基础(蛋白质聚集，剪切，磷酸化等修饰)(重点)。
带着理论中存在的实验问题，回到实验中去掌握具体的实验原理及操作。(1)PCR原理：DNA合成，3步反应循环；(2)引物(探针)设计原理：11条，结合TNF可溶性编码序列的扩增引物讲解(重点)；(3)PCR扩增体系：各组分(特别是dNTP、Mg、Taq酶)，浓度，纯度要求，使用时注意点；(4)PCR扩增条件：温度、循环次数，各种类型PCR仪简介；(5)PCR衍生技术(T-A克隆、RT-PCR、荧光定量PCR等)和用途。
2.2 第二节课：理论教授内容
(1)质粒：概念，质粒不相容性；严紧性与松弛型质粒差别的基础；其他常用载体(重点)；(2)限制性内切酶：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ特征，Ⅱ型详介(回文结构、粘端、平端、同尾酶)(重点)；酶切图谱；(3)连接酶：T4 DNA连接酶，其他连接酶；(4)其他工具酶；(5)定向克隆；(6)细胞组分。同时对应本节带出的要掌握实验操作：(1)质粒抽提试剂盒原理、各溶液组分和作用，操作要点(重点)；(2)限制性内切酶反应条件，使用注意事项(甘油影响，质粒纯化时酒精残余的影响)；(3)凝胶回收试剂盒原理、各溶液组分和作用，操作要点；(4)连接酶反应条件，使用注意事项(彻底融化和溶解，温度，胶回收纯化时酒精残余的影响)；(5)电泳详解：各类电泳(琼脂糖凝胶电泳，薄膜电泳，SDS-PAGE等，水平式、垂直、管状、脉冲等)原理；核酸电泳操作要点(凝胶浓度，核酸浓度测算，分子量测算)，适用范围，注意事项(重点)。(6)细胞组分分离：破碎细胞方法(物理方法：反复冻融，超声，(高压)匀浆；化学方法：酸解，碱裂解(质粒抽提)；生物方法：各种酶解)。
2.3 第三节课：理论教授内容
(1)外源基因导入宿主方式(接合，转化，转染，转导，感染等)；感受态；(2)重组子筛选原理(质粒-抗性、生化标志，外源DNA片段，表达产物)。同时对应本节带出的要掌握的实验操作：(1)转化(CaCl2法)：操作要点：恒低温(0℃)保持，复苏温度与时间；(2)蓝白斑筛选。
2.4 第四节课：理论教授内容
(1)蛋白质的哪些性质可作为蛋白质分离纯化的依据？(2)重组蛋白表达的特性(包涵体的形成，融合表达，诱导表达)；(3)抗体简介：结构，类型(一抗，二抗；单抗，多抗，抗血清；(酶、荧光等)标记抗体)；(4)蛋白质功能研究策略。
同时对应本节带出的要掌握实验操作：(1)盐析：原理；分段盐析；(2)离心技术详解：转速(超速)，离心力；密度梯度离心；差速离心；温度，真空度；(3)层析：分子筛(分子量测算，纯度测算)(重点)；其他方法(离子层析，亲和层析，反相，HPLC等)；方法的选择；(4)SDS-PAGE(分子量测算，纯度测算)(重点)；Western-blot分析：操作要点(膜，电转移，封闭，显色：底物，化学发光，荧光)；(5)活性测定：分子相互作用分析；酶活性分析，细胞功能分析，动物模型分析。
2.5 第五节课：总复习
(1)分子克隆原理与流程总结；(2)基因功能研究策略：表达；表达调控；产物(蛋白质)结构，理化性质鉴定，相互作用，功能研究。
3 开放教学，注重思考
在教学中采用的是以小组为单位进行讨论，开展实验探索活动，以培养学生的探究能力。每节理论与操作课完成后预留部分时间，让学生带着思考回顾内容，在讨论中，每个成员是平等的，可以自由地发表个人的见解，通过讨论可以集思广益，互相合作，加速知识的同化。
3.1 第一节课思考题
(1)PCR时降低退火温度对反应有何影响？(2)PCR时延长变性时间对反应有何影响？(3)PCR时循环次数是否越多越好？为什么？(4)PCR时如果出现非特异性带，可能有哪些原因？(5)如要阐述某蛋白质分子的结构与功能，应如何展开？
3.2 第二节课思考题
(1)质粒的基本性质有哪些？(2)质粒载体与天然质粒相比有哪些改进？(3)在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题？(4)如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动，你认为可能是什么原因？(5)琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？(6)设计实验来判断双酶切时，证实2个限制性内切酶都起到了作用。
3.3 第三节课思考题, 百拇医药(钟山 高云 孙铭娟 杨生生 张建鹏 王梁华)