探针药物法评价奥拉西坦对大鼠体内CYP3A酶活性的影响(1)
摘要：目的：研究奥拉西坦连续多次灌胃给药对大鼠CYP3A酶活性的影响。方法：40只SD大鼠随机分为2组，实验组大鼠每天一次奥拉西坦(200mg·kg-1)灌胃，对照组每天1次蒸馏水灌胃(1.5mL)；连续5日，于第6日，2组大鼠均单剂量尾静脉注射咪达唑仑10mg·kg-1，后由眼底静脉丛取血，高效液相色谱法测定血药浓度，以DAS 2.1.1 药物动力学程序拟合药动学参数，以SPSS18.0 软件对组间各参数进行统计分析。结果：咪达唑仑标准曲线方程为：Y=0.0752X-0.0042(r=0.9999)，线性范围为0.1-30mg·L-1；；方法回收率高中、低浓度分别为(104.9±4.30)%、(101.6±3.28)%和；(109.8±4.54)%，对照组与实验组主要药动学参数：t1/2、Cmax、AUC0-12h无显著性差异。结论：合用奥拉西坦前后，咪达唑仑在大鼠体内主要药动学参数无明显变化，提示奥拉西坦对大鼠体内CYP3A4无影响。
促智药奥拉西坦(oxiracetam，ORC)具有很好的改善记忆和学习功能，临床常用于理化因素所致脑缺氧、慢性脑功能不全及智能、记忆力障碍等的治疗[1]。奥拉西坦对对肝微粒体酶影响研究尚少，其代谢途径尚不清晰。本研究将咪达唑仑作为探针药物[2]，探讨奥拉西坦对CYP3A 酶活性的影响[3-4]，为与其他临床药物联合用药合理性提供参考依据。
关键词：奥拉西坦；咪达唑仑；CYP3A4；高效液相色谱法；药动学
1 仪器与材料
1 仪器与材料
1.1 仪器
Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，美国Waters公司)；涡旋混合器(XW-80A，上海医科大学仪器厂)；冷冻离心机(GL-20G-Ⅱ，上海安亭科学仪器厂)；高效液相色谱系统。
1.2试验用药
乙腈(天津市康科德科技有限公司，批号：111203)。奥拉西坦对照品(中诺药业有限公司-石药集团，纯度99.60%，批号：128101207)；咪达唑仑对照品(宜昌人福药业责任有限公司，含量100.8%，批号MD111106)；咪达唑仑注射液(规格5ml：5mg，江苏恩华药业集团有限公司，批号20110825)注射用奥拉西坦(规格1.0g，批号262120318)石药集团欧意药业有限公司，1.3 实验动物
雄性SD大鼠，清洁级，体重(300±10)g，动物许可证号SCXK(晋)2009-0001，由山西省动物实验中心提供。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(62：38，V/V)；进样量：20μL，柱温：30℃；检测波长：225nm；流速：1.0mL·min-1。
2.2 血浆样品处理
室温下自然解冻血浆样品，以10000r·min-1速度离心5min后取200μL上清液于塞离心管中，加入20μl内标溶液混匀后(150μg/ml地西泮溶液为内标液)，加提取剂(异丙醇：乙酸乙酯=2：8)500μl，涡旋震荡1min，10000rpm离心5min，取上清液500μl，37℃水浴下氮气流吹干，残渣用100μl甲醇复溶后进样处理。
2.3 方法学
2.3.1专属性试验
取咪达唑仑和内标地西泮对照品溶液进样。然后取空白血浆及灌胃后给咪达唑仑的血浆样品进样处理、测定并记录色谱图。结果提示我们在相应色谱条件下，咪达唑仑保留时间为6.7min。且峰形良好，内标保留时间为8.2min峰形良好，，咪达唑仑的测定未受大鼠血浆中内源性物质干扰。见图1.
2.3.2 标准曲线
按“2.1.2”项下方法，将浓度分别为30，20，10，5，1，0.25，0.1，μg /ml的咪达唑仑模拟血浆样品，进行处理测定。以测得的咪达唑仑峰面积与内标的峰面积之比(Y)对血浆药物浓度(X)进行线性回归，得到标准曲线方程为Y=0.0752X-0.0042(r=0.9999，n=7)，在0.1～30mg·L-1浓度范围内具有良好的线性关系。。
2.3.3 回收率
咪达唑仑及内标提取回收率：将空白血浆15份，分为3组，每组5份，分别制备20μg/ml、5μg/ml、0.25μg/ml的咪达唑仑模拟血浆样品，按照2.2血浆样品处理进行测定并记录峰面积值。咪达唑仑提取回收率计算为咪达唑仑峰面积与直接进样的对照品溶液峰面积比值；内标提取回收率为地西泮峰面积与直接进样的对照品溶液峰面积比值。
方法回收率：将空白血浆15份，分为3组，每组5份，分别制备20μg/ml 、5μg/ml、0.25μg/ml的咪达唑仑模拟血浆样品，依照上面2.2血浆样品处理方法测定后记峰面积数值。方法回收率为计算测得浓度与加入浓度的比值。
2.3.4精密度
取空白血浆15份，分3组，每组5份，依次制备20μg/ml0、 5μg/ml、25μg/ml的咪达唑仑模拟血浆样品，同样依照2.2血浆样品处理方法处理，并在一天的不同时间段测定，计算日内精密度；于0，1，2，3，4日处理并测定，计算日间精密度。模拟血浆样品三种不同浓度的日内精密度、日间精密度的RSD值分别为6.38%，3.23%、11.05%、均在规定范围内，表明该方法精密度良好。
2.3.5稳定性试验
根据需要，分别考察了样品室温放置的稳定性，长期冷冻保存稳定和反复冻融稳定性。结果表明：室温下阴暗干燥处放置4h，-40℃低溫避光保存10d，反复冻融3 次，RSD< 6.4%，能够很好的满足血清样品测定的需要。, 百拇医药(刘宏达 任静华 谭显惠 吕增禄 王淑梅)
促智药奥拉西坦(oxiracetam，ORC)具有很好的改善记忆和学习功能，临床常用于理化因素所致脑缺氧、慢性脑功能不全及智能、记忆力障碍等的治疗[1]。奥拉西坦对对肝微粒体酶影响研究尚少，其代谢途径尚不清晰。本研究将咪达唑仑作为探针药物[2]，探讨奥拉西坦对CYP3A 酶活性的影响[3-4]，为与其他临床药物联合用药合理性提供参考依据。
关键词：奥拉西坦；咪达唑仑；CYP3A4；高效液相色谱法；药动学
1 仪器与材料
1 仪器与材料
1.1 仪器
Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，美国Waters公司)；涡旋混合器(XW-80A，上海医科大学仪器厂)；冷冻离心机(GL-20G-Ⅱ，上海安亭科学仪器厂)；高效液相色谱系统。
1.2试验用药
乙腈(天津市康科德科技有限公司，批号：111203)。奥拉西坦对照品(中诺药业有限公司-石药集团，纯度99.60%，批号：128101207)；咪达唑仑对照品(宜昌人福药业责任有限公司，含量100.8%，批号MD111106)；咪达唑仑注射液(规格5ml：5mg，江苏恩华药业集团有限公司，批号20110825)注射用奥拉西坦(规格1.0g，批号262120318)石药集团欧意药业有限公司，1.3 实验动物
雄性SD大鼠，清洁级，体重(300±10)g，动物许可证号SCXK(晋)2009-0001，由山西省动物实验中心提供。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(62：38，V/V)；进样量：20μL，柱温：30℃；检测波长：225nm；流速：1.0mL·min-1。
2.2 血浆样品处理
室温下自然解冻血浆样品，以10000r·min-1速度离心5min后取200μL上清液于塞离心管中，加入20μl内标溶液混匀后(150μg/ml地西泮溶液为内标液)，加提取剂(异丙醇：乙酸乙酯=2：8)500μl，涡旋震荡1min，10000rpm离心5min，取上清液500μl，37℃水浴下氮气流吹干，残渣用100μl甲醇复溶后进样处理。
2.3 方法学
2.3.1专属性试验
取咪达唑仑和内标地西泮对照品溶液进样。然后取空白血浆及灌胃后给咪达唑仑的血浆样品进样处理、测定并记录色谱图。结果提示我们在相应色谱条件下，咪达唑仑保留时间为6.7min。且峰形良好，内标保留时间为8.2min峰形良好，，咪达唑仑的测定未受大鼠血浆中内源性物质干扰。见图1.
2.3.2 标准曲线
按“2.1.2”项下方法，将浓度分别为30，20，10，5，1，0.25，0.1，μg /ml的咪达唑仑模拟血浆样品，进行处理测定。以测得的咪达唑仑峰面积与内标的峰面积之比(Y)对血浆药物浓度(X)进行线性回归，得到标准曲线方程为Y=0.0752X-0.0042(r=0.9999，n=7)，在0.1～30mg·L-1浓度范围内具有良好的线性关系。。
2.3.3 回收率
咪达唑仑及内标提取回收率：将空白血浆15份，分为3组，每组5份，分别制备20μg/ml、5μg/ml、0.25μg/ml的咪达唑仑模拟血浆样品，按照2.2血浆样品处理进行测定并记录峰面积值。咪达唑仑提取回收率计算为咪达唑仑峰面积与直接进样的对照品溶液峰面积比值；内标提取回收率为地西泮峰面积与直接进样的对照品溶液峰面积比值。
方法回收率：将空白血浆15份，分为3组，每组5份，分别制备20μg/ml 、5μg/ml、0.25μg/ml的咪达唑仑模拟血浆样品，依照上面2.2血浆样品处理方法测定后记峰面积数值。方法回收率为计算测得浓度与加入浓度的比值。
2.3.4精密度
取空白血浆15份，分3组，每组5份，依次制备20μg/ml0、 5μg/ml、25μg/ml的咪达唑仑模拟血浆样品，同样依照2.2血浆样品处理方法处理，并在一天的不同时间段测定，计算日内精密度；于0，1，2，3，4日处理并测定，计算日间精密度。模拟血浆样品三种不同浓度的日内精密度、日间精密度的RSD值分别为6.38%，3.23%、11.05%、均在规定范围内，表明该方法精密度良好。
2.3.5稳定性试验
根据需要，分别考察了样品室温放置的稳定性，长期冷冻保存稳定和反复冻融稳定性。结果表明：室温下阴暗干燥处放置4h，-40℃低溫避光保存10d，反复冻融3 次，RSD< 6.4%，能够很好的满足血清样品测定的需要。, 百拇医药(刘宏达 任静华 谭显惠 吕增禄 王淑梅)