第08章 细胞凋亡于肿瘤 .doc
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第八章 细胞凋亡于肿瘤
第一节 细胞凋亡的基本特点及其检测方法
一、细胞凋亡和细胞坏死的区别
特 点 细胞凋亡 细胞坏死形态学方面： 细胞体积萎缩.与周围细胞分离细胞肿胀 细胞膜膜发泡，通透性下常，细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻(PS)完整性破坏，通透性增加 细胞核先固缩，后降解溶解 溶酶体完整裂解 线粒体浓缩，跨膜电位受损，细胞色素c释放肿胀，破坏，能量生成受损生物化学方面 DNA非随机性DNA裂解，ladder，核小体间剪切非特征性剪切 蛋白质Caspases活化非特征性降解 底物特异性降解非特异性水懈 抗死亡分子Bcl 2家族，Caspases 抑制剂有时受Bcl-2调控 对ATP的要求必需无需 组织分布单个细胞细胞群体 结局(组织反应被吞噬细胞吞噬，不引起炎症反血释放细胞碎片，引起炎症反应二、评价凋亡的基本方法
(一)细胞膜完整性和细胞形态学的评价
多数体外培养体系中，凋亡细胞并不能被机体清除。最终它们将和坏死细胞一样，发生细胞膜的损伤和肿张、裂解。因此，应用培养细胞研究细胞凋亡的发生机制时.严格区分这种继发性坏死(secondary necrosis)和真正意义上的细胞坏死是非常重要的。
1.细胞膜完整性的评判：台盼蓝去染法和丫啶橙/溴化丙啶双染法。丫啶橙(AO)和溴化丙啶EB都是结合DNA的荧光染料，分别产生蓝色和橙色荧光。其中AO能透过完整的细胞膜，而EB则只能染色胞膜受损的细胞。
2.应用光学显敝镜的形态学检测：它仍然是区分细胞凋亡和坏死的最基本和最重要的手段。
3 应用电子显微镜的形态学检测 ：超微结构观察可显示凋亡细胞的许多特点。
(二)DNA断裂的检测方法
* 在细胞凋亡中非随机性DNA裂解产生的寡核小体片段在琼脂糖凝胶电泳图谱上表现为特征性的DNA梯子(DNA ladder)
* 3H-TdR预先标记细胞内DNA后，离心分离降解(低分子量DNA)和完整(高分子量DNA)组分，并分别测定两个组分的DNA含量。根据降解DNA组分占整个细胞DNA的百分率间接地对凋亡细胞进行定量测定。
* 原位末端标记(in Situ end-labeling)技术也是定量凋亡细胞的有效方法
(三)流式细胞仪在细胞凋亡中的应用
* 流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是分析细胞学研究的重要工具。
* 凋亡细胞在固定和清洗时，降解的小分子量DNA外漏，导致细胞内DNA含量减少。凋亡细胞常常以亚二倍体形式出现。该亚二倍体细胞群被称为亚Gl期(sub-G1)细胞。它的出现被认为是细胞凋亡的重要标志。
(四)Annexin V的检测
* 磷脂酰丝氨酸外翻是早期凋亡细胞的重要特征之一。
* 依赖Ca2+的磷脂结合蛋白Annexin V能够和PS高亲和结合。敏感探针，用于凋亡细胞的检测
(五)原位末端标记技术
* ISEL技术是根据DNA聚合酶能够填补双链DNA中单链的缺失部分的基本原理，应用标记的三磷酸核苷酸形成新的DNA。
* 最常用的是荧光素FITC标记三磷酸核苷酸。因此，可以通过FCM或荧光显微镜检测相应的荧光强度，达到了解DNA是否断裂和发生DNA断裂的细胞的数量。
* 根据采用的DNA聚合酶不同，ISEL至少包括三种方法：①DNA缺口平移法：②原位末端标记法：③末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法(TUNEL)：
三、细胞凋亡的生物学意义概述
* 在多细胞生物体，特定组织器官的细胞类型和细胞数量是相对恒定的。这种恒定主要取决于细胞增殖和凋亡之间的动态平衡。
* 和细胞增殖一样，细胞凋亡对于多细胞生物体的发育和稳态的维持是至关熏要的，* 细胞凋亡明显影响胚胎和婴儿发育的所有方面。
* 细胞DNA损伤可诱导抑癌基因p53的表达。它使细胞停滞于G1期，以便提供足够的时间对损伤的DNA进行修复(参见第四章)。在细胞损伤严重以致修复无能的情况下，p53则触发细胞凋亡。
* 细胞凋亡和衰老密切相关。1. 清除损伤或无功能的细胞，并以新细胞替代之，从而保持组织自稳态；2. 清除不可替代的分裂后细胞如神经元、心肌细胞，使机体免患疾病。
第二节 细胞凋亡的发生机制
* 细胞凋亡的发生发展过程可划分为三个时期，即诱导期、效应期和降解期。
* 最重要的是凋亡活化基因Ced-3、Ced-4和凋亡抑制基因Ced-9。
* 它们诱导和调控细胞凋亡的基本机制是：
* Ced-3是具严格底物特异性的"半胱氨酸蛋白酶"。它通常以酶原(前体)的形式存在于细胞内。
* 细胞凋亡时，活化的Ced-3特异地降解蛋白底物，诱导凋亡细胞的特征性形态学和生物化学变化。
* Ced-4既能结合Ced-3，也能与Ced-9结合。
* 在非凋亡细胞，Ced-9以Ced-4为中介和Ced-3结合成三体复合物，扣押Ced-3使其以无活性的酶原形式存在于细胞内。
* 在凋亡诱导信号的作用下，Ced-9自复合物中解离。这可能与新近发现的EGL-1有关。
* EGL-1能够结合Ced-9.并替代三体复合物中的Ced-4/Ced-3，导致Ced-3在Ced-4的用下活化，并促使细胞凋亡。
* Ced-3和Ced-9在人体的类似物分别代表两大家族，即Caspases家族和Bcl-2家族
* 与Ced-4同源的只有凋亡活化因子(Apaf-l)。
* 哺乳动物细胞凋亡机制的认识?已经发展为两种概念。
* 其一，Caspase在细胞凋亡过程中发挥重要作用。
* 其二，过去从凋亡细胞主要表现为细胞核的改变出发，提出细胞凋亡发生的始动环节存在于细胞核。新近研究显示细胞核的改变是细胞凋亡的结果，而不是其原因。
一、Caspases和细胞凋亡
Caspases 1993年，袁钧英等发现Ced-3基因与哺乳动物细胞白细胞介素-1?转化酶(interlukin -? converting enzyme, ICE)存在功能和序列相似性。和Ced3一样，ICE的高表达可导致啮齿动物成纤维细胞凋亡。随后发现14个ICE/Ced-3家族成原。为了避免命名上的混乱，袁钧英等在1996年10月组成了一个专门小组，推荐将ICE/ced-3家族成员统一命名为 Caspase (Cysteinyl Aspartate-specific Proteinases)，而对其家族成员，则按发现先后为序，在 Caspases后以阿拉伯数字表示。
(一)Caspases的结构和活性特点
* Caspases家族有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性。它们都以酶原形式表达。
* Caspase酶原由?原结构域(prodomain)、大亚基和小亚基构成。
* Caspase属于?半胱氨酸蛋白酶 ......
第八章 细胞凋亡于肿瘤
第一节 细胞凋亡的基本特点及其检测方法
一、细胞凋亡和细胞坏死的区别
特 点 细胞凋亡 细胞坏死形态学方面： 细胞体积萎缩.与周围细胞分离细胞肿胀 细胞膜膜发泡，通透性下常，细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻(PS)完整性破坏，通透性增加 细胞核先固缩，后降解溶解 溶酶体完整裂解 线粒体浓缩，跨膜电位受损，细胞色素c释放肿胀，破坏，能量生成受损生物化学方面 DNA非随机性DNA裂解，ladder，核小体间剪切非特征性剪切 蛋白质Caspases活化非特征性降解 底物特异性降解非特异性水懈 抗死亡分子Bcl 2家族，Caspases 抑制剂有时受Bcl-2调控 对ATP的要求必需无需 组织分布单个细胞细胞群体 结局(组织反应被吞噬细胞吞噬，不引起炎症反血释放细胞碎片，引起炎症反应二、评价凋亡的基本方法
(一)细胞膜完整性和细胞形态学的评价
多数体外培养体系中，凋亡细胞并不能被机体清除。最终它们将和坏死细胞一样，发生细胞膜的损伤和肿张、裂解。因此，应用培养细胞研究细胞凋亡的发生机制时.严格区分这种继发性坏死(secondary necrosis)和真正意义上的细胞坏死是非常重要的。
1.细胞膜完整性的评判：台盼蓝去染法和丫啶橙/溴化丙啶双染法。丫啶橙(AO)和溴化丙啶EB都是结合DNA的荧光染料，分别产生蓝色和橙色荧光。其中AO能透过完整的细胞膜，而EB则只能染色胞膜受损的细胞。
2.应用光学显敝镜的形态学检测：它仍然是区分细胞凋亡和坏死的最基本和最重要的手段。
3 应用电子显微镜的形态学检测 ：超微结构观察可显示凋亡细胞的许多特点。
(二)DNA断裂的检测方法
* 在细胞凋亡中非随机性DNA裂解产生的寡核小体片段在琼脂糖凝胶电泳图谱上表现为特征性的DNA梯子(DNA ladder)
* 3H-TdR预先标记细胞内DNA后，离心分离降解(低分子量DNA)和完整(高分子量DNA)组分，并分别测定两个组分的DNA含量。根据降解DNA组分占整个细胞DNA的百分率间接地对凋亡细胞进行定量测定。
* 原位末端标记(in Situ end-labeling)技术也是定量凋亡细胞的有效方法
(三)流式细胞仪在细胞凋亡中的应用
* 流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是分析细胞学研究的重要工具。
* 凋亡细胞在固定和清洗时，降解的小分子量DNA外漏，导致细胞内DNA含量减少。凋亡细胞常常以亚二倍体形式出现。该亚二倍体细胞群被称为亚Gl期(sub-G1)细胞。它的出现被认为是细胞凋亡的重要标志。
(四)Annexin V的检测
* 磷脂酰丝氨酸外翻是早期凋亡细胞的重要特征之一。
* 依赖Ca2+的磷脂结合蛋白Annexin V能够和PS高亲和结合。敏感探针，用于凋亡细胞的检测
(五)原位末端标记技术
* ISEL技术是根据DNA聚合酶能够填补双链DNA中单链的缺失部分的基本原理，应用标记的三磷酸核苷酸形成新的DNA。
* 最常用的是荧光素FITC标记三磷酸核苷酸。因此，可以通过FCM或荧光显微镜检测相应的荧光强度，达到了解DNA是否断裂和发生DNA断裂的细胞的数量。
* 根据采用的DNA聚合酶不同，ISEL至少包括三种方法：①DNA缺口平移法：②原位末端标记法：③末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法(TUNEL)：
三、细胞凋亡的生物学意义概述
* 在多细胞生物体，特定组织器官的细胞类型和细胞数量是相对恒定的。这种恒定主要取决于细胞增殖和凋亡之间的动态平衡。
* 和细胞增殖一样，细胞凋亡对于多细胞生物体的发育和稳态的维持是至关熏要的，* 细胞凋亡明显影响胚胎和婴儿发育的所有方面。
* 细胞DNA损伤可诱导抑癌基因p53的表达。它使细胞停滞于G1期，以便提供足够的时间对损伤的DNA进行修复(参见第四章)。在细胞损伤严重以致修复无能的情况下，p53则触发细胞凋亡。
* 细胞凋亡和衰老密切相关。1. 清除损伤或无功能的细胞，并以新细胞替代之，从而保持组织自稳态；2. 清除不可替代的分裂后细胞如神经元、心肌细胞，使机体免患疾病。
第二节 细胞凋亡的发生机制
* 细胞凋亡的发生发展过程可划分为三个时期，即诱导期、效应期和降解期。
* 最重要的是凋亡活化基因Ced-3、Ced-4和凋亡抑制基因Ced-9。
* 它们诱导和调控细胞凋亡的基本机制是：
* Ced-3是具严格底物特异性的"半胱氨酸蛋白酶"。它通常以酶原(前体)的形式存在于细胞内。
* 细胞凋亡时，活化的Ced-3特异地降解蛋白底物，诱导凋亡细胞的特征性形态学和生物化学变化。
* Ced-4既能结合Ced-3，也能与Ced-9结合。
* 在非凋亡细胞，Ced-9以Ced-4为中介和Ced-3结合成三体复合物，扣押Ced-3使其以无活性的酶原形式存在于细胞内。
* 在凋亡诱导信号的作用下，Ced-9自复合物中解离。这可能与新近发现的EGL-1有关。
* EGL-1能够结合Ced-9.并替代三体复合物中的Ced-4/Ced-3，导致Ced-3在Ced-4的用下活化，并促使细胞凋亡。
* Ced-3和Ced-9在人体的类似物分别代表两大家族，即Caspases家族和Bcl-2家族
* 与Ced-4同源的只有凋亡活化因子(Apaf-l)。
* 哺乳动物细胞凋亡机制的认识?已经发展为两种概念。
* 其一，Caspase在细胞凋亡过程中发挥重要作用。
* 其二，过去从凋亡细胞主要表现为细胞核的改变出发，提出细胞凋亡发生的始动环节存在于细胞核。新近研究显示细胞核的改变是细胞凋亡的结果，而不是其原因。
一、Caspases和细胞凋亡
Caspases 1993年，袁钧英等发现Ced-3基因与哺乳动物细胞白细胞介素-1?转化酶(interlukin -? converting enzyme, ICE)存在功能和序列相似性。和Ced3一样，ICE的高表达可导致啮齿动物成纤维细胞凋亡。随后发现14个ICE/Ced-3家族成原。为了避免命名上的混乱，袁钧英等在1996年10月组成了一个专门小组，推荐将ICE/ced-3家族成员统一命名为 Caspase (Cysteinyl Aspartate-specific Proteinases)，而对其家族成员，则按发现先后为序，在 Caspases后以阿拉伯数字表示。
(一)Caspases的结构和活性特点
* Caspases家族有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性。它们都以酶原形式表达。
* Caspase酶原由?原结构域(prodomain)、大亚基和小亚基构成。
* Caspase属于?半胱氨酸蛋白酶 ......
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