丁香园电子期刊2005年第2期

    免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策

    shewlyn及所有参与讨论站友

    免疫学技术讨论版

    shewlyn：

    良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。 由于免疫组化染色过程中

    存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张

    高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相

    互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样

    的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片(即无阳性信号)和“杂音”染色片(有

    阳性信号) 。

    一、 无色片

    染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种

    现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达

    与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为

    两种情况：(1) 、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病

    理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是

    获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医

    生也起着不可缺少的作用。 (2) 、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进

    行抗原修复， 有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而

    不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但

    偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染

    色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制

    DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出

    现棕色。如果出现了，证明三抗和 DAB 的配制过程没有错误。如果这种 DAB 再滴到切片

    上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定

    在三抗 DAB 或 DAB 的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原

    因。

    解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染

    色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织

    或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步

    骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”

    或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在 T和 B

    细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织

    或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择

    自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称

    为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素

    瘤，需要用 HMB45 或 Mart-1 来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病

    变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中丁香园电子期刊2005年第2期

    不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组

    织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一

    种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前国内外有单位将多

    种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储

    备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性

    对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑

    肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。

    设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。病理医生观察了HE 切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医生在

    免疫组化中的作用是不可忽视的。

    抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。

    二、“杂音”染色片

    免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色， 这些非正常的着色

    称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其

    归纳为下面几种。

    1、 全片着色

    全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织

    是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：

    (1) 、抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应

    当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使

    是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。

    (2) 、抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时

    表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法(Polymer)敏感

    性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的 1 小时，而是 30 分钟，因此，要根据染色结果进

    行调整。

    (3) 、DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制

    好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB

    产生反应而降低 DAB 的效力，未用完的 DAB 存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办

    法是不可取的。DAB 的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。

    不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体

    显色时进行监控，避免显色时间过长。

    (4) 、组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴

    液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用 DAKO 笔或 PAP

    Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。

    (5) 、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长(大于 24小时) ：原因上不清楚，但现象存在。

    有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切

    片和修复液的容器放在4oC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏

    天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。 (6) 、一抗变质、质量差的多克隆抗体：

    注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对

    照和用使用过的抗体作比较。

    2、 切片边缘着色 丁香园电子期刊2005年第2期

    切片边缘着色也是一种常见的现象，这种现象称为边缘效应。产生的原因：(1) 、组织

    边缘与玻片粘贴不牢， 边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。

    解决办法：制备优质的胶片(APES 或多聚赖氨酸) ，切出尽量薄的组织切片，不厚于 4 微

    米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。 (2) 、切片上滴加的试剂未充

    分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深 ......