流感病毒的实验室快速诊断方法(下)(1)
随着流感实验技术的不断发展，快速诊断方法也在不断进步，下面将介绍几种流感实验室先进的实验方法。与经典的实验方法比较，其灵敏度大大提高，而实验所需时间却下降到1—2天甚至是15分钟。但它的特异性较经典的实验方法差且须要现代化的辅助设备。
第二部分 现代流感实验室快速诊断方法
第一章 酶联免疫吸附试验(ELISA)
一、概况
酶联免疫吸附试验技术(Enzyme immunosorbent assay，简称ELISA)，以免疫过氧化物酶技术为基础，创立于1971年。它的基本原理：抗原或抗体吸附到固相载体的表面仍保持其免疫活性；抗原或抗体与酶所形成的结合物各自保持其免疫学活性和酶的催化活性；结合物与相应的抗体或抗原反应后，免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时，可催化底物水解、氧化或还原，从而产生有色物质，可用肉眼观察。由于反应颜色的深浅与相应抗体或抗原的量成正比，故可对抗体或抗原进行定量测定。
, 百拇医药
ELISA敏感性高(灵敏度可达l0-9一10-12)，特异性强，操作简便，肉眼可观察，便于大规模检测，适合于现场和基层使用，它具有荧光免疫及放射免疫的许多优点，又避免了它们许多缺点。因此，ELISA被认为是近代血清学上革命性的新成果。目前它已广泛应用于和疾病有关的细菌、病毒、寄生虫、肿瘤、自身免疫和血液等抗原抗体系统的定性或定量测定。在流感病毒研究中，ELISA主要应用于流感的快速诊断和单克隆抗体挑选。
二、ELISA在流感病毒快速诊断中的应用
(一)抗流感病毒免疫血清IgG的提取
1.取xml血清加xml生理盐水，滴加2倍xm1饱和硫酸铵，边滴边搅拌，室温静置30min或4℃过夜，1000r/min离心10min，弃上清。
2.用生理盐水将沉淀物溶至xm1，按同法滴加xm1饱和硫酸铵，置室温30min以上，按同法离心，弃上清。重复3次。
, 百拇医药
3.沉淀物用少量生理盐水溶解，装入透析袋，置生理盐水中透析，一般需3天，每天换液两次，直至用1%BaCl2测不出SO42-，或用奈氏试剂测不出NH4+时为止。
4.透析后的IgG溶液可用冷冻干燥法浓缩，或装在透析袋内，周围撤上聚乙二醇(分子量600)吸水浓缩，最简单的办法是将透析袋悬挂起来，用电风扇吹。
5.IgG抗体工作浓度的测定： 首先在MDCK细胞系统测定出IgG抗体对本身抗原的ELISA效价，使用浓度应为4—8倍的效价；在此浓度不应对不同亚型和不同型病毒株有任何交叉反应。尽量少用鸡的免疫血清来提取IgG，因市场上难买到酶标记的抗鸡IgG的抗血清。如实在需要用这种抗血清，需用下法制备：将正常鸡血清按上述方法提取出IgG；采正常家兔免疫血清；然后从家兔耳静脉每天注射0.5m1提取的IgG，连续注射一周，最后一次注射后7天试血。用双扩法进行测定，在扩散板上打两组扩散孔，第一组为试血组，中间孔放正常鸡血清，周围分别放1:2—1:32不同稀释度的试血血清(抗鸡IgG的血清)，第二组为对照组，中间孔同样放正常鸡血清，四周分别放1:2—1:32不同稀释度的免疫血清；对照组不应出现任何沉淀线，当实验组1:8以上稀释度都能出现清晰的沉淀线时，可马上放血，收集血清。如果效价达不到要求，须多点皮内注射提取的IgG进行加强免疫，一周后再试血，如仍达不到要求即放弃,换新兔子重新免疫。, 百拇医药(丁丽新)
第二部分 现代流感实验室快速诊断方法
第一章 酶联免疫吸附试验(ELISA)
一、概况
酶联免疫吸附试验技术(Enzyme immunosorbent assay，简称ELISA)，以免疫过氧化物酶技术为基础，创立于1971年。它的基本原理：抗原或抗体吸附到固相载体的表面仍保持其免疫活性；抗原或抗体与酶所形成的结合物各自保持其免疫学活性和酶的催化活性；结合物与相应的抗体或抗原反应后，免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时，可催化底物水解、氧化或还原，从而产生有色物质，可用肉眼观察。由于反应颜色的深浅与相应抗体或抗原的量成正比，故可对抗体或抗原进行定量测定。
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ELISA敏感性高(灵敏度可达l0-9一10-12)，特异性强，操作简便，肉眼可观察，便于大规模检测，适合于现场和基层使用，它具有荧光免疫及放射免疫的许多优点，又避免了它们许多缺点。因此，ELISA被认为是近代血清学上革命性的新成果。目前它已广泛应用于和疾病有关的细菌、病毒、寄生虫、肿瘤、自身免疫和血液等抗原抗体系统的定性或定量测定。在流感病毒研究中，ELISA主要应用于流感的快速诊断和单克隆抗体挑选。
二、ELISA在流感病毒快速诊断中的应用
(一)抗流感病毒免疫血清IgG的提取
1.取xml血清加xml生理盐水，滴加2倍xm1饱和硫酸铵，边滴边搅拌，室温静置30min或4℃过夜，1000r/min离心10min，弃上清。
2.用生理盐水将沉淀物溶至xm1，按同法滴加xm1饱和硫酸铵，置室温30min以上，按同法离心，弃上清。重复3次。
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3.沉淀物用少量生理盐水溶解，装入透析袋，置生理盐水中透析，一般需3天，每天换液两次，直至用1%BaCl2测不出SO42-，或用奈氏试剂测不出NH4+时为止。
4.透析后的IgG溶液可用冷冻干燥法浓缩，或装在透析袋内，周围撤上聚乙二醇(分子量600)吸水浓缩，最简单的办法是将透析袋悬挂起来，用电风扇吹。
5.IgG抗体工作浓度的测定： 首先在MDCK细胞系统测定出IgG抗体对本身抗原的ELISA效价，使用浓度应为4—8倍的效价；在此浓度不应对不同亚型和不同型病毒株有任何交叉反应。尽量少用鸡的免疫血清来提取IgG，因市场上难买到酶标记的抗鸡IgG的抗血清。如实在需要用这种抗血清，需用下法制备：将正常鸡血清按上述方法提取出IgG；采正常家兔免疫血清；然后从家兔耳静脉每天注射0.5m1提取的IgG，连续注射一周，最后一次注射后7天试血。用双扩法进行测定，在扩散板上打两组扩散孔，第一组为试血组，中间孔放正常鸡血清，周围分别放1:2—1:32不同稀释度的试血血清(抗鸡IgG的血清)，第二组为对照组，中间孔同样放正常鸡血清，四周分别放1:2—1:32不同稀释度的免疫血清；对照组不应出现任何沉淀线，当实验组1:8以上稀释度都能出现清晰的沉淀线时，可马上放血，收集血清。如果效价达不到要求，须多点皮内注射提取的IgG进行加强免疫，一周后再试血，如仍达不到要求即放弃,换新兔子重新免疫。, 百拇医药(丁丽新)