流感病毒的实验室快速诊断方法(下)(3)
第二章 免疫荧光技术
一、概况
免疫荧光技术(1mmunofuorescence technique)由组织化学和免疫学方法结合而成。它实际上包括荧光技术和荧光抗原技术两部分，是以特异性抗原抗体反应为基础，利用荧光色素作为标记物标记已知抗体(或抗原)，在特定条件下检测未知抗原或抗体的免疫学检测方法。
免疫荧光技术是Coons等于1942年发明的，但自1958年稳定的荧光色素一异硫氰酸荧光素(F1uoresin isthiocyanate，FITC)问世后，整个技术包括荧光色素的合成研制、荧光标记试剂的制备以及检测手段等才得到了突飞猛进的发展。目前该法已广泛应用于医学和生理学领域。在流感病毒研究领域主要应用于快速诊断。
由于单克隆抗体的问世，大大提高了免疫荧光测定的效果。免疫荧光最大优点为：敏感性和特异性高。其缺点：需免疫荧光显微镜，工作人员需具有一定的经验。
二、材料
(一)荧光素
理想的荧光索应易与抗体蛋白结合而又不易脱落，且不损伤抗原的特异性和敏感性。另外荧光素本身性能稳定，易溶解，荧光强，标记方法简便也是不可忽视的。目前常用的荧光素有以下几种:
1.异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)
异硫青酸荧光素为黄色、橙黄色或褐黄色的结晶形，溶解状态下呈黄绿色，有两种异构体，易溶于水和酒精等溶剂，于低温下干燥可保存多年，室温下保存两年以上。两种异构体都能与蛋白质良好地结合
2.四甲基异硫氰硫罗丹明(Tetramethyl rhodamine isothiocyanate ,TMRITC)
此荧光素通过异硫基与蛋白质结合，呈粉红色荧光，与异硫青酸荧光素的黄绿色呈鲜明对照，多用于双标记示踪。
3.丽丝胺罗月明(Lissamine rhodamine,RB200)
4.二氯三嗪基荧光素(Dichlorotrrriazinyl-aminofluorescein,DHAF)
(二)荧光显微镜
(三)流感病毒抗血清最好为单抗
(四)荧光标记的抗体血清
三 荧光抗体染色
(一)直接法
1.固定：将待检标本置预冷的丙酮中固定10分钟。
2.冲洗：在pH7.4的PBS中洗3次。
3.染色：滴加相应荧光抗体，37℃湿盒结合30分钟。
4.冲洗：用pH7.4的PBS充分洗。
5.晾干，封片观察：封片用90%甘油，10% 10mol/L PH7.2的PBS, 百拇医药(丁丽新)
一、概况
免疫荧光技术(1mmunofuorescence technique)由组织化学和免疫学方法结合而成。它实际上包括荧光技术和荧光抗原技术两部分，是以特异性抗原抗体反应为基础，利用荧光色素作为标记物标记已知抗体(或抗原)，在特定条件下检测未知抗原或抗体的免疫学检测方法。
免疫荧光技术是Coons等于1942年发明的，但自1958年稳定的荧光色素一异硫氰酸荧光素(F1uoresin isthiocyanate，FITC)问世后，整个技术包括荧光色素的合成研制、荧光标记试剂的制备以及检测手段等才得到了突飞猛进的发展。目前该法已广泛应用于医学和生理学领域。在流感病毒研究领域主要应用于快速诊断。
由于单克隆抗体的问世，大大提高了免疫荧光测定的效果。免疫荧光最大优点为：敏感性和特异性高。其缺点：需免疫荧光显微镜，工作人员需具有一定的经验。
二、材料
(一)荧光素
理想的荧光索应易与抗体蛋白结合而又不易脱落，且不损伤抗原的特异性和敏感性。另外荧光素本身性能稳定，易溶解，荧光强，标记方法简便也是不可忽视的。目前常用的荧光素有以下几种:
1.异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)
异硫青酸荧光素为黄色、橙黄色或褐黄色的结晶形，溶解状态下呈黄绿色，有两种异构体，易溶于水和酒精等溶剂，于低温下干燥可保存多年，室温下保存两年以上。两种异构体都能与蛋白质良好地结合
2.四甲基异硫氰硫罗丹明(Tetramethyl rhodamine isothiocyanate ,TMRITC)
此荧光素通过异硫基与蛋白质结合，呈粉红色荧光，与异硫青酸荧光素的黄绿色呈鲜明对照，多用于双标记示踪。
3.丽丝胺罗月明(Lissamine rhodamine,RB200)
4.二氯三嗪基荧光素(Dichlorotrrriazinyl-aminofluorescein,DHAF)
(二)荧光显微镜
(三)流感病毒抗血清最好为单抗
(四)荧光标记的抗体血清
三 荧光抗体染色
(一)直接法
1.固定：将待检标本置预冷的丙酮中固定10分钟。
2.冲洗：在pH7.4的PBS中洗3次。
3.染色：滴加相应荧光抗体，37℃湿盒结合30分钟。
4.冲洗：用pH7.4的PBS充分洗。
5.晾干，封片观察：封片用90%甘油，10% 10mol/L PH7.2的PBS, 百拇医药(丁丽新)