流感病毒的实验室快速诊断方法(下)(4)
(二)间接法
标本固定:同上。
1.冲洗:同上。
2.第一抗体结合:滴加未标记的第一抗体于被检标本上,37℃湿盒结合30分钟。
3.冲洗:同上。用PBS
4.与第二抗体既免疫荧光抗体作用:滴加荧光标记抗体,37℃湿盒结合30分钟。
5冲洗:用pH7.4的PBS充分冲洗。
6.凉干、封片、观察:同直接法。
7.结果判断:
“一”表示见不到荧光。
“土”表示只能见到极弱的可疑荧光。
“十”表示荧光较弱,但清晰可见。
“十十”表示可见到明亮的荧光。
“十十十一十十十十”表示荧光闪亮,而且范围广。
四、间接荧光抗体染色(IIF)在检测流感病毒中的应用
间接荧光抗体染色是当今流感快速诊断中应用得最为广泛的技术之一,一种是直接测定息者鼻咽部标本中的流感病毒颗粒或病毒特异的蛋白亚单位,另一种是将采集的标本接种MDCK细胞,让病毒扩增后,查MDCK中病毒颗粒或病毒特异的蛋白亚单位。前者虽然有时当天可出结果,但检出率低,同时非特异性染色强,因采样时,很难采到足够数量鼻咽脱落的细胞,而且采集标本中杂质多;而后者,虽然第二天才能出结果,但检出率高,同时非特异性物质少。故近来多用后者,其具体操作方法如下。
(一)标本接种
取两小瓶成片的MDCK细胞,弃生长液,用Hank’s液洗两遍;一瓶接种采集标本1.0ml,另一瓶(对照瓶)接种1.0ml维持液;置35℃孵育1—2小时;取出,弃接种液,用Hank’s液选一遍;每瓶加入3mI维持液,置35℃过夜培养。
(二)制做细胞片
1.取对照瓶细胞,刮取贴壁细胞。
2.将细胞加入300μl PBS摇匀。
3.在栽玻片第1,2孔内各加入10 μl上述细胞悬液。
4.按同法制作待检细胞片,分别加在5,6孔及7,8孔。
5.室温晾干并作标记。
(三)荧光抗体染色
1.将栽玻片在80%丙酮中固定10分钟,取出晾干。
2.将栽玻片置于平皿中,于1,5,6孔加1滴抗甲型流感病毒NP的单克隆抗体;于2,7,8孔加1滴抗乙型流感病毒NP的单克隆抗体。置37℃孵育30分钟。, 百拇医药(丁丽新)
标本固定:同上。
1.冲洗:同上。
2.第一抗体结合:滴加未标记的第一抗体于被检标本上,37℃湿盒结合30分钟。
3.冲洗:同上。用PBS
4.与第二抗体既免疫荧光抗体作用:滴加荧光标记抗体,37℃湿盒结合30分钟。
5冲洗:用pH7.4的PBS充分冲洗。
6.凉干、封片、观察:同直接法。
7.结果判断:
“一”表示见不到荧光。
“土”表示只能见到极弱的可疑荧光。
“十”表示荧光较弱,但清晰可见。
“十十”表示可见到明亮的荧光。
“十十十一十十十十”表示荧光闪亮,而且范围广。
四、间接荧光抗体染色(IIF)在检测流感病毒中的应用
间接荧光抗体染色是当今流感快速诊断中应用得最为广泛的技术之一,一种是直接测定息者鼻咽部标本中的流感病毒颗粒或病毒特异的蛋白亚单位,另一种是将采集的标本接种MDCK细胞,让病毒扩增后,查MDCK中病毒颗粒或病毒特异的蛋白亚单位。前者虽然有时当天可出结果,但检出率低,同时非特异性染色强,因采样时,很难采到足够数量鼻咽脱落的细胞,而且采集标本中杂质多;而后者,虽然第二天才能出结果,但检出率高,同时非特异性物质少。故近来多用后者,其具体操作方法如下。
(一)标本接种
取两小瓶成片的MDCK细胞,弃生长液,用Hank’s液洗两遍;一瓶接种采集标本1.0ml,另一瓶(对照瓶)接种1.0ml维持液;置35℃孵育1—2小时;取出,弃接种液,用Hank’s液选一遍;每瓶加入3mI维持液,置35℃过夜培养。
(二)制做细胞片
1.取对照瓶细胞,刮取贴壁细胞。
2.将细胞加入300μl PBS摇匀。
3.在栽玻片第1,2孔内各加入10 μl上述细胞悬液。
4.按同法制作待检细胞片,分别加在5,6孔及7,8孔。
5.室温晾干并作标记。
(三)荧光抗体染色
1.将栽玻片在80%丙酮中固定10分钟,取出晾干。
2.将栽玻片置于平皿中,于1,5,6孔加1滴抗甲型流感病毒NP的单克隆抗体;于2,7,8孔加1滴抗乙型流感病毒NP的单克隆抗体。置37℃孵育30分钟。, 百拇医药(丁丽新)