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编号:10298952
流感病毒的实验室快速诊断方法(下)(2)
http://www.100md.com 2003年9月26日 好医生
     收集的血清进行酶标记,即为酶标记的抗鸡IgG抗血清。

    (二)80%丙酮制备 8份丙酮2份生理盐水配制,4℃保存待用。

    (三)长成片的MDCK细胞

    (四)待检标本和对照标本

    (五)实验步骤:

    1.长成片的MDCK细胞,弃生长液,用Hank’s液洗两次。

    2.在细胞板上按图4—1做标记(甲1型,甲3型,乙型为当前人群主要流行病毒株)。既每份标本3孔,按图4—1所示,每孔加入0.1ml相应标本。

    3.盖好盖子,35℃ CO2孵箱培养2小时。

    4.取出,倒掉接种液,用Hank’s液洗两次,每孔加入0.1ml细胞维持液(见第二章),35℃CO2孵箱过夜培养。

    5.取出,倒掉细胞维持液,用生理盐水洗两次,每孔加入0.1ml/孔80%丙酮,4℃20—30分钟。

    6.倒掉丙酮,孔朝上,置室温30一60min,让丙酮完全挥发掉。

    7.按图4—1所示,分别加入0.1ml/孔工作浓度的抗血清,置室温结合1—2小时。

    8.倒掉抗血清,用洗涤液洗5遍,晾干,加工作浓度的酶标抗体,0.1m1/孔。如用兔的就得用酶标记兔的IgG抗血清;如用鼠单抗就得用酶标抗鼠的IgG抗血清。室温孵育1—2h。

    9.例掉第二抗体,用洗涤液洗5遍,晾干。

    10.加入OPD—H202底物0.1m1/孔,置盒子中(不能露光),室温20分钟。

    11.结果观察与判断。

    首先观察对照组:加维持液的不应显色;阳性对照组只能本身对本身的显色,对不同亚型和不同型的不应显色;实验组:与甲3亚型血清显色的,表明待检标本为甲3亚型,同理为甲l亚型或乙型。

    近来国外多用混合的单克隆抗体,因单克隆抗体特异性强,用单个的易发生漏检,用多个混在一起就可大大提高检出率。有时用混合的抗Np的单克隆抗体,这样只能查出特检标本是甲型还是乙型流感病毒。

    为提高了标本的检出率,常常每标本接种18孔以上。凡1—2孔出现阳性就可判为阳性标本。

    由于病毒通过MDCK细胞扩增后,大大提高了标本的检出率,同时MDCK细胞不存有与底物显颜色的内酶来影响ELISA测定,方法也较简便,第二天就可出结果。故MDCIK—ELISA为目前流感诊断中用得最广泛的方法之一。

    最后观察结果时,也可以下列形式进行:(1)每孔加入底物,置室温30分钟。(2)弃底物,用PBS洗两次.(3)每孔加100一300 μl PBS。(4)用阅片灯或白色灯光背景观察各孔染色,或以倒置显微镜察看细胞染色。

    在显微镜下,正常未感染病毒的细胞不着色,而感染病毒的细胞整个胞体呈暗红色。

    由于临床标本中常含有上皮细胞、酵母菌或其它细胞碎片,而这些杂质常带黄色或浅棕色,因此,必须仔细观察加以区别。, http://www.100md.com(丁丽新)
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