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编号:11682226
血管紧张素Ⅱ和胰岛素对平滑肌细胞三磷酸肌醇活性的影响.ppt
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    血管紧张素Ⅱ和胰岛素对平滑肌细胞三磷酸肌醇活性的影响

    天津医科大学第二医院心脏科

    马向红

    前 言

    > 肾素-血管紧张素系统在高血压的发病机制中具有重要作用,临床研究发现高血压患者较正常血压者更易发生糖尿病,糖尿病患者发生高血压的危险性高于血压正常者,高血压和糖尿病患者常表现为胰岛素抵抗。

    > 血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素1型(AT1)受体拮抗剂不仅能降低血压,而且能提高胰岛素的敏感性,提示血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与胰岛素抵抗之间具有相互作用。

    前 言

    * AngII可以激活磷脂酶水解细胞膜磷脂并产生信号分子,在培养的平滑肌细胞5秒钟之内PLC被激活,水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)生成肌醇1,4,5-三磷酸 (inositol trisphosphate, IP3)和二酰甘油(diacyl glycerol, DG)。

    * IP3和DG作为第二信使分别激动两个信号传递途径即IP3/Ca2+和DG/PKC通路,IP3通过作用于内质网膜上特异的受体使其内部Ca2+释放,引起胞内Ca2+水平增加,从而启动胞内Ca2+信号系统,即通过依赖Ca2+、钙结合蛋白(如钙调素)的酶类活性变化来调节生理过程。

    前 言

    * 然而,AngⅡ与胰岛素同时存在情况下对IP3和钙调素活性的影响目前尚不十分清楚。本文旨在探讨AngII和胰岛素对人脐动脉平滑肌细胞IP3和钙调素活性的影响。

    材料和方法

    * 人脐动脉平滑肌细胞培养和鉴定:采用组织贴块法,?-actin免疫组织化学检查细胞胞浆呈棕褐色鉴定为平滑肌细胞。

    第2-3代细胞用于实验,用胰蛋白酶消化后接种于24孔培养板,浓度为2×106/ml。静置24小时后换成无血清细胞培养液,孵育24小时使细胞处于静止状态再进行实验。

    实验分组:

    * 对照组,为无血清的M1640培养液

    * 不同浓度胰岛素组(10、100、1000mU/L)

    * 不同浓度血管紧张素Ⅱ组(0.1 nM、0.5nM、1nM)

    * 不同浓度胰岛素(10、100、1000mU/L)+不同浓度AngⅡ组(0.1 nM、0.5nM、1nM)

    * 不同浓度AngⅡ组(0.1 nM、0.5nM、1nM)+不同浓度losartan组(1、5、10μM)

    每组为6孔细胞。

    检测方法:实验24小时后刮取细胞测定钙调素(CaM)和三磷酸肌醇(IP3)。

    * 钙调素测定:采用磷酸二酯酶(PDE)法。

    贴壁培养的人脐动脉平滑肌细胞,用预冷的PBS缓冲液洗3遍,用细胞刮将细胞刮下,制成细胞悬液,细胞数为2?106/ml。

    加入50?l PDE混合液,混匀,30?C 预热10分钟。

    加入100?l反应混合液,30?C水浴20分钟,煮沸1分钟。

    立即放入冰水浴中,加入1mg/ml蛇毒50?l,混匀,放置30?C水浴中保温20分钟。

    加入30% Dowex 400?l,混匀,1000转/分离心10分钟,取上清液200?l置于闪烁瓶中。

    加入3ml无水乙醇和7ml闪烁液,于?液闪计数仪中测定cpm,根据标准曲线计算出钙调素含量。

    * IP3测定:6孔板培养的平滑肌细胞,加入3H-肌醇 (10?Ci/孔,由中国原子能研究院标记)和不同浓度的胰岛素、AngⅡ和Losartan培养24小时。

    弃去培养液,用预保温的反应缓冲液洗1次,弃去。

    用2ml反应缓冲液37 ?C孵育10分钟,弃去,重复一次。

    加入氯仿/甲醇/盐酸(1:2:0.25,V/V/V)1ml终止反应。

    刮取细胞,收集细胞于离心管中,加入0.6ml氯仿/水(1:1,V/V),振摇。

    1000转/分离心5分钟,70?C水浴保温10分钟取出氯仿,收集水相层(约0.4ml)于柱中。

    先后经过10ml双蒸水,10ml 60mM甲酸铵/5mM硼酸钠、10ml 0.2M甲酸铵/0.1M甲酸、10ml 0.7M甲酸铵/0.1M甲酸、10ml 1.05M甲酸铵/0.1M甲酸逐步洗脱。

    流速3-4滴/分钟。

    收集1.05M甲酸铵/0.1M甲酸过柱后含有IP3的洗脱液。

    取2ml洗脱液于闪烁瓶中,60?C蒸发至残余液体约200?l,加入闪烁液和无水乙醇,?液闪仪计数,IP3以cpm/孔表示。

    统计学处理:数据以均数±标准差表示,用SPSS10.0统计软件处理,多组间比较用方差分析,两两比较用q检验。p<0.05具有统计学差异。

    结 果

    表1 胰岛素对平滑肌细胞IP3和钙调素活性的影响(x±s, n=6)

    注:Insulin:胰岛素(单位:mU/L) ......

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